INFORS HT Multitron & Minitron shaking incubator 震盪培養箱

專為懸浮式細胞(Cells)、微生物(Microorganisms)、光合生物(Phototrophic organisms)
培養設計之震盪培養箱

INFORS HT shaking incubator 最人

 

您是否還在克難的把shaker擺進incubator內培養CHO、293E細胞或是細菌E-coli?

缺點如下:

1.shaker本體占空間: 高度變低,同時浪費旁邊空隙空間 (若為底部水盆式的培養箱,還需再墊高)

2.瓶子擺放需對稱: 多數為單中軸shaker,若擺放不平衡易造成中軸歪斜損壞或攪拌不均

3.噪音: 部分shaker運轉聲較大

4.易產熱: 部分shaker長時間運作易產熱造成培養箱內部溫度不均

5.需開門才可調整轉速: 頻繁開關門導致溫度、濕度與CO2濃度時常變化,對培養較不佳

6.Shaker忘了開或斷電停止而不自知: 易造成整批培養生物的損失

   

外加shaker,空間利用度差INFORS HT shaking incubator 最人

 

INFORS HT shaking incubator 將shaker與培養箱一體化,將以上缺點化為優點:

 

INFORS HT shaking incubator 最人

五軸shaker超平衡,易拆易清潔

    

1.shaker高度低: 內部擺瓶空間更寬廣,可放5 L錐形瓶

2.五軸磁力shaker驅動: 不需刻意對稱擺放也能維持平衡搖擺

3.shaker運轉安靜

4.shaker長時間運作不易產熱

5.門外轉速控制: 調整轉速不需開關門

6.開關門,shaker自動關開機: 安全不怕忘記開shaker

 

除了以上優點解決外加shaker的不便外,INFORS HT還貼心設計了:
 

1.可連網監控: 透過網路即時得知機台狀況,也可加設警報器

2.活動式承載盤: 承載盤可從培養箱拉出,不必伸手到內部即可拿到後端瓶子

3.易拆洗清潔: shaker可拆卸,底部圓角好洗不藏汙,玻璃門易擦拭

4.外掛蒸氣式加濕: 水瓶於箱外好觀察水量、密閉無菌並以微電腦控制內部濕度以達濕度均衡,解決傳統水盤蒸發式的濕度分佈不均、易發霉與需時常開門觀察水量的缺點

5.功能擴充性高: 可配合各種培養條件調整參數如:製冷、CO2濃度、濕度、進氣、厭氧、遮光、光照強度

6.培養箱直接堆疊: 同機型可直接兩層(Minitron)或三層(Multitron)疊放,中間不必訂製支架分隔

7.最高高度適宜: 最高三層堆疊(Multitron)承載盤僅140 cm,最高把手高度為186 cm,適用多數成人使用者

8.雙層玻璃門: 良好的隔熱與透光且平整表面易清潔

9.UV空氣殺菌(選配): 維持箱內無菌環境 (UV燈管隔絕不影響培養物)

與門一體成型操作面板

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乙太網路接口

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搭配Sticky stuff 水洗式黏貼板,空間利用最大化!!

INFORS HT shaking incubator 最人

黏貼板,自由拼貼

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隨易黏,不挑瓶,排列緊密省空間

 

INFORS HT shaking incubator 最人

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Multitron 3層疊放 (下掀門)

Minitron 2層疊放 (側掀門)


 

規格比較表:

  Multitron Minitron
Dimensions
(W x D x H)
1070 mm x 880 mm x 695 mm (one unit) / 1070 mm x 880 mm x 1850 mm (three units) 800 mm x 625 mm x 700 mm (one unit) / 800 x 625 x 1490 mm (two units)
Maximum working height 585 mm (one unit) / 1400 mm (three units) 173 mm (one unit) / 960 mm (two units)
Number of batches 7680 per unit 105 per unit
Volume 21 L per unit 9 L per unit
Maximum load 55 kg per unit 12 kg per unit
Maximum expansion Up to 3 units can be stacked Up to 2 units can be stacked
Rotation speed 20–400 min-1 (3mm: 1'000 min-1) depending on load and stacking 20–400 min-1 depending on load and stacking
Shaking throw 3 mm / 25 mm / 50 mm / adjustable  25 mm / 50 mm
Temperature without cooling max. 10 °C above AT to 65 °C Minimum temperature from 4 °C depending on cooling system 5 °C above ambient temperature to 65 °C 16 °C below AT to 65 °C with cooling; Minimum temperature 4 ° C
Standard parameters Temperature, rotation speed, timer
Optional parameters Cooling, humidity, CO2, light intensity
Ambient humidity (rH) Up to 85 % non-condensing
Power supply 115/230 V ± 10%, 50/60 Hz

 

 

 

若有更多培養問題,歡迎於部落格留言與我們討論,或參考

INFORS HT 台灣代理 欣梗科技股份有限公司INFORS HT shaking incubator 最人

 

欣梗科技搬家囉!!

338桃園市蘆竹區長興路一段205巷30號5樓 / 03-212-6700

ww.lefoscience.com / info@lefoscience.com

 

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KrosFlo® KR2i TFF System 切向流濃縮透析系統

實現真正全自動化濃縮、透析、純化、補液系統
 

KR2i TFF 全自動濃縮透析系統with KONDUiT.jpg

 

桌上型全自動切向流濃縮透析系統,符合cGMP要求,為量產等級的先導測試與線性放大準備之機型,適用Hollow fiber與TFF cassette,組合彈性、操作簡易且自動達到濃縮與透析倍率後停機;全數值與實驗參數自動記錄在Excel中;平板電腦觸控控制並可將電腦遠端移至BSC外使用。

 

Principle of KR2i TFF system.gif

 

 

模組化設計自由搭配配件如:微電腦幫浦、重量停機秤、壓力檢測儀即蛋白質與溫度檢測儀等...

 

濃縮模式-單幫浦單秤 (左圖); 濃縮透析補液模式 2-3幫浦雙秤(右圖)

KR2i TFF system 2 mode.JPG

 

 

六種自動化模式組合濃縮、透析、補液自由搭配,到達條件即自動執行下一步指令

KR2i TFF 6 mode map.jpg

C: concentration 濃縮模式

D: dialysis 透析模式(換液模式)

CF: constant feeding 持續饋料模式

 

 

Excel即時存取所有數據並自動計算完畢

12種條件記錄
 
in Excel.jpg
  • 時間 (Time)
  • 入口端壓力 (Inlet pressure)
  • 回流端壓力 (Retentate pressure)
  • 過濾端壓力 (Permeate pressure)
  • 入口流速 (Feed flow rate)
  • 幫浦轉速 (Pump RPM)
  • 幫浦模式 (Pump mode)
  • 過濾流速 (Permeate flow rate)
  • 提醒 (Notes, alarm, process status, functions)
  • 過濾透析流速 (Diafiltration flow rate)
  • 樣品重量 (Feed scale weight)
  • 過濾端重量 (Permeate scale weight)

 

03.JPG

 

自動計算8種參數
 

  • 穿膜壓力 (Transmembrane pressure; TMP)
  • 過濾流速 (Permeate flow rate)
  • 回流流速 (Retentate flow rate)
  • 流量 (Flux)
  • 壓降 (Pressure drop; ΔP
  • 容積通過量 (Volumetric throughput; VT)
  • 濃縮因子 (Concentration factor)
  • 剪切力 (Shear)

 

04.JPG

 

 

微電腦蠕動幫浦-標準配備幫浦頭,適用六種矽膠管,隨意搭配,靈活運用

Peristaltic pump KR1_Angle.jpg

轉速範圍: 0.1~600 rpm

流量範圍: 0.06~2300 ml/min

 

Tubing size L/S 13 L/S 14 L/S 16 L/S 25 L/S 17 L/S 18
Inner diameter 0.8 mm (0.03") 1.6 mm (0.06") 3.1 mm (0.12") 4.8 mm (0.19") 6.4 mm (0.25") 7.9 mm (0.31")
Hose barb size 1.6 mm (1/16") 1.6 mm (1/16") 3.2 mm (1/8") 4.8 mm (3/16") 6.4 mm (1/4") 9.5 mm (3/8")
Flow range
(approximate)
0.06 to 36 ml/min 0.21 to 130 ml/min 0.8 to 480 ml/min 1.7 to 1000 ml/min 2.8 to 1700 ml/min 3.8 to 2300 ml/min
Compatible pump head

Compatible pump head.JPG

 

可更換成附廠幫浦頭,補足其他四種矽膠管大小               

masterflex-7720062-easy-load-ii-head-for-high-performance-tubing-pps-ss-7720062.jpg

轉速範圍: 0.1~600 rpm

流量範圍: 1.7~2900 ml/min

               

 

Tubing size L/S 15 L/S 24 L/S 35 L/S 36
Inner diameter 4.8 mm (0.19") 6.4 mm (0.25") 7.9 mm (0.31") 9.7 mm (0.38")
Hose barb size 4.8 mm (3/16") 6.4 mm (1/4") 9.5 mm (3/8") 9.5 mm (3/8")
Flow range
(approximate)
1.7 to 1000 ml/min
(1.8 to 1000 ml/min)
2.8 to 1700 ml/min
(3.0 to 1800 ml/min)
3.8 to 2300 ml/min
(4.3 to 2600 ml/min)
4.8 to 2900 ml/min
(5.8 to 3400 ml/min)
Compatible pump head

Compatible pump head-2.JPG

 

 

 

自動背壓調節裝置,隨時調節壓力至最佳狀態

Back pressure control valve.JPG

 

 

 

KONDUiT add-on monitor

KONDUiT.jpg

即時監測電導率,UV和溫度

Conductivity:   0.1 to 100 mS/cm
Temperature:  0-70°
Pressure:         up to 75 psi (5 bar)

 

 

兩種切向流過濾(Tangential Flow, TFF)皆適用

Hollow fiber 中空纖維膜 TFF cassette 匣式(平板)濾膜
Spectrum Repligen hollow fiber  for KR2i.JPG TangenX™ PRO Reusable TFF Cassettes.jpg

 

 

 

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Tel: 02-28321066
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SpectraFlo™ Dynamic Dialysis Systems 動態透析系統

大體積的溫和透析法~

SpectraFlo dialysis system2.JPG

 

生技醫療產業常用的透析方式是將不穩定或黏滯性高的物質以透析袋(半透膜)隔離並利用濃度差的方式達到去除鹽份、少量有機溶劑、小分子物質或雜質。相關原理請參考:最新透析的技術與應用

透析袋使用示意:

 


一般以透析袋透析需耗費兩天兩夜且總共需更換8-10次不等的透析液才可達到最佳的透析效果,但面對大量的樣品,除了需要又大又長的透析袋裝填外,更需要更大容器的透析桶來承載透析袋與透析液。

 

大體積透析比較,以200 ml為例:

 

傳統透析法

動態透析系統
 

02.JPG

01.JPG

空間 至少需20 L透析桶 只需2.2 L 透析柱,底座直徑僅30.5 cm
外液處理 抬起傾倒,費力 蠕動幫浦使用,省力
環境 開放式,需頻繁移動透析袋至新的透析桶中 封閉式,不需移動透析袋,較無汙染
擾流方式 磁石攪拌 流動式,可直接排放掉或循環式
濃度差 隨透析時間越久濃度差越低 一直保持高濃度差
多工性 通常一桶一袋-若一桶多放,則不能攪拌,否則易攪纏在一起 透析柱中可加上隔板,同時一柱兩袋,或串聯式透析
效率 1-2天,耗時 <1天,省時

 

使用Spectrum/Repligen的動態透析系統,因搭配蠕動幫浦自動補液換液,膜內外維持高濃度差,達到高效率透析!

Dynamic dialysis system.jpg

 

動態透析示意:

 

兩小時後,左圖靜置方式,外液呈現淡粉紅色,濃度差低;反之右圖動態透析,外液澄清無色,濃度差高

Static VS dynamic dialysis.JPG

 

一小時後,動態透析效率比靜置方式快上 10 %

Static VS dynamic dialysis-2.JPG

 

增加透析液流動速率(Flux rate),透析效果更好!

dynamic dialysis with different flow rate-2.JPG

 

也可使用串聯透析方式同時處理多個透析袋

Series Operation - SpectraFlo™ Process System .JPG

 

多種大小管柱選擇,單柱樣品體積最大可達 2 公升!

SpectraFlo™ Dynamic Dialysis with different size tank.jpg

 

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CAR-T病毒10倍濃縮只要30分鐘!

取代離心式濃縮,以Hollow fiber中空纖維膜做切向流(tangential flow/cross flow)濃縮,省時有效率,高達95 % 以上樣品回收率!

mini TFF 切向流過濾系統 MAP.03 sytem

 

MAP.03 mini TFF system.png

 

實驗目的: 將原50 ml含有CAR-T之病毒培養液濃縮至5 ml

實驗方法: 以Spectrum_Repligen hollow fiber (C02-E300-05-N)並搭配迷你幫浦MAP.03做過濾濃縮

20190815_152449.jpg

整組Hollow fiber與連通管路以gamma ray無菌處理並於無菌操作台中操作使用,免去0.22 um過濾除菌!

 

 

  濃縮大車拼
  Hollow fiber 切向流 傳統離心
裝置圖

MAP.03 mini TFF system.JPG

spin column.jpg

原理

樣品流向平行濾膜,不易堵塞

Cross Flow.jpg

樣品流向垂直濾膜,易堵塞

Dead End.jpg

50 cc
10倍濃縮時間
約30 min 需分裝離心 15 cc/tube >1 hr
回收率 >95 % 易沾黏在膜上,回收率較差

 

迷你輕巧! 冰箱中4度C 自動操作、自動停機也OK!!

20190816_105845.jpg

 

 

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  之前從CAR-T製程過程,從細菌到病毒 (上篇)已介紹含有專一性辨認之基因片段的質體(plasmid)是如何透過細菌複製增量,接下來就是將質體送入T細胞中最終使其表現CAR於細胞表面上,送入方式常見的有電穿孔(electroporation)與病毒感染(virus infection),前者是在細胞外外加短暫高電壓,使細胞膜通透力暫時性增加來讓外源基因進入細胞中,而本篇將著重於病毒感染法來介紹。

 

電穿孔原理:

electroporation.jpg

圖片來源: Mol Ther. 2009 May;17(5):922-8.

 

簡易的病毒感染流程如下:

 

CAR-T process 2.jpg

 

何謂病毒感染式的基因轉殖呢? 簡單來說就是利用病毒會將自身DNA送到宿主細胞內的特性,將我們的目標基因送到細胞中,再利用細胞本身轉錄轉譯能力將目標基因轉譯成功能性蛋白。

在生物技術上最常使用反轉錄病毒(retrovirus)、腺病毒(adenovirus)和慢病毒(lentivirus)三種來當作我們的基因遞送者:

 

A: 反轉錄病毒(Retrovirus)

一種RNA病毒,進入宿主後會反轉錄作用將RNA反轉成DNA,並將DNA嵌入宿主染色體中,因此就能藉由宿主複製而複製,具外套膜且只能感染分裂中的細胞

 

B: 腺病毒(Adenovirus)

為一種DNA病毒,經用內吞作用(endocytosis)進入宿主細胞中,進入後再釋出其DNA進入宿主細胞核中,不具外套膜但能感染分裂中或不分裂的細胞,腺病毒最後會破宿主細胞膜而出。

 

C: 慢病毒(Lentivirus)

為一種RNA病毒,屬反轉錄病毒的一種,外套膜表面與宿主細胞膜受體辨認後藉由膜融合(membrane fusion)進入宿主中,但與反轉錄病毒的差別在於其可感染分裂或不分裂的細胞

 

以慢病毒為例,為降低基因轉殖操作的危險性,除了目標質體外,通常還有包裹載體(package vector,又稱結構蛋白載體 structure protein vector)及外套膜載體(envelope vector),將三者一同送入包裹細胞(packaging cell ex:293T)內進行複製、表現與病毒組裝,其經過逆轉錄作用製造載體DNA及轉譯出病毒的蛋白外殼與外套膜,最後於細胞中組裝成病毒型態後再釋放到細胞外。此過程通常需要兩到三天以蒐集足夠量且含有目標質體的病毒。

 

慢病毒包裝與感染步驟:

lentivirus-production-mirus-bio-recombinant.png

 

將含病毒的培養基收下來後,傳統會使用高速離心的方式分離培養基中的細胞碎屑再以超高速離心來濃縮病毒提高效價,近代則推薦使用Hollow fiber(HF) 0.5, 0.65 μm以切向流過濾的方式做培養液澄清再以300, 500 kD HF做初步濃縮,之後利用層析管柱分離出病毒,再用100, 300 kD HF做最後濃縮以及0.2 µm的無菌過濾,結合上篇所述,不論是在細菌階段或是在細胞的病毒組裝階段都可以用到切向流過濾濃縮系統(Tangential Flow system; TFF)系統來做濃縮、分離、除菌與澄清,只需更換HF與矽膠管件即可。

(參考快速病毒濃縮(無菌操作)的新思維; 不可思議!! 200倍病毒濃縮透析換液僅花35分鐘完成!!)

 

TFF 切向流過濾系統,從2 mL~500 L

Tangential Flow TFF system-2.jpg

 

得到濃縮後具有CAR的病毒後,接下來就可以用來感染從病患血液中分離出來的T細胞囉! 步驟如下圖:

 

CAR-T.jpg

 

結合上下兩篇所述, 要改造T細胞的前置步驟就需經歷: 專一性質體設計、細菌轉殖培養放大、病毒包裝放大、分離濃縮等重重步驟,這樣的演進都是結合眾多科學家們辛苦研究的結晶,才造就人類在醫療技術上的突破,雖然現今CAR-T細胞治療仍有許多副作用與侷限性,不過隨著科學與醫療快速進步,期許未來CAR-T細胞療法能更廣泛的應用與更安全。

 

 

 

 

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在先前的文章:Hollow Fiber製備CAR-T載體與品質的檢測中,我們介紹到CAR-T的原理與應用,但在使用慢病毒感染T-cell改造成CAR-T前是需要進行重重步驟,本篇將跟各位介紹具有目標基因的病毒是如何被製造,過程又大致可分為細菌培養放大質體(Plasmid)與哺乳細胞培養放大慢病毒(ex: Lentivirus),放大慢病毒的部分將在下一篇再跟大家介紹。簡易的細菌放大步驟圖如下:

 

Process of gene cloning and E-coli collection, clarification %26; concentration  .jpg

 

首先將專一性辨認目標物(ex:癌細胞)的基因片段接在載體(Vector)上,稱為基因接合作用(Gene ligation),而接合後稱為質體(Plasmid),因載體有供細菌辨認的位置,因此當基因片段送入膜通透力好的細菌(勝任細胞;Competent cell)時,質體可隨著細菌複製並繁衍下去,如此以來質體就能夠被等比放大,此步驟稱為轉形作用(Transformation)。

Porcess of gene cloning and E-coli culture-2.jpg

搭配Ultra yield flask細胞養(氧)量倍增瓶(可參考:搖瓶的小改變,細胞與產物即可倍增; 提高 E. Coli細胞密度與增進蛋白質表現的關鍵因子)與專用透氣蓋(專屬2.5L Ultra Yield 搖瓶的Vented Cap出爐了!!)將細菌置於incubator中震盪培養放大(參考:令人折服的設計:INFORS Multitron震盪培養箱),若為量產等級,則可選用發酵槽(又稱生物反應器; Bioreactor)做更大量的培養放大。

 

 

細菌經震盪培養後,可用中空纖維膜(Hollow fiber; HF) 500/750 kD收菌,之後經過破菌處理,再用HF 2 μm做質體澄清及100/300 kD做質體濃縮,此一系列的收菌、質體澄清與質體濃縮的步驟,都可以透過切向流過濾濃縮系統(Tangential Flow system; TFF)來完成(參考: 出乎意料的快與高效率之細胞分離方法!!; 「濃縮與透析」產程放大!從這二步驟開始……)

 

Hollow fiber TFF system from small to large volume

Tangential Flow TFF system-2.jpg

 


 

得到大量高濃度的質體後,就可進入下一步來製造含有CAR的病毒了!此部分留在下篇再向各位介紹囉!

 

更多細胞細菌培養、濃縮透析問題,歡迎於部落格留言與我們討論,或參考

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RAPID CLEAR® CAP 3000

Rapid clear cap 3000.jpg

      High-speed clarification of cell culture

還在用傳統濾杯過濾培養液嗎?

Filter funnel.JPG

不先把細胞分裝離心,濾杯過濾很快就塞住了…             

 

centrifuge tube cartoon.JPGcentrifuge cartoon.JPG

 

 

 

 

 

 

 

 

 

過濾救星~! THOMSON  RAPID CLEAR® CAP 3000 學士帽造型濾杯!

Rapid clear cap4.JPG

0.2 μm filter直接接在搖瓶上,免分裝離心免倒出快速又安全!

Rapid clear cap faster CHO HEK.jpg

省時省錢!   省下用離心機的時間與開銷

capital equipment cost comparison.JPG

省下13倍以上的時間!

Rapid clear cap time in minutes graph.jpg

一個學士帽抵   4個 !!   500 cc濾杯

Rapid clear cap vs filter funnel.jpg

 

搭配 Optimum Growth Flask搖瓶 瓶頸加寬,高通氣低剪切力,產量更好!

corning flask vs thomson optium growth flask.JPG

 

參考的使用體積與所需時間         註: 不同細胞總類與濃度,所需時間會略有不同

 Cell Line Viability 99 %-70 % 69 %-50 % 49 %-40 % 39 %-0 %
Spin for 7 min @ 4000 g*
 Cell Type Volume (L) Time (min) Volume (L) Time (min) Volume (L) Time (min) Volume (L) Time (min)
 CHO Stable without Feed 3.0 18 2.5 18 2.0 20 3.5** 35**
 CHO Stable, 1 to 2 Feeds 2.0 18 2.0 18 1.5 35    
 CHO Stable, 2+ Feeds Spin for 15 min @ 3000 g; ≦3 L volume **
 HEK293 (FreeStyleTM & Expi293) 3.0 18 3.0 23 3.0 25 3.5** 35**
 CHO Transient 3.0 18 2.5 18 1.5 35    
 ExpiCHO 3.0 18 2.5 18 1.0 18    

* For low viability cultures, (< 39%), centrifuge for 7 minutes prior to clarifying with the Rapid Clear® Cap 3000.
** Cell cultures that received 2+ feeds will require spinning to minimize potential clogging

 

實作影片

 

想要增進實驗效率嗎? 趕快來電詢問!!

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Tel: 02-28321066
E-mail: info@lefoscience.com

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Configuration of hollow fiber cartridges and flat sheet cassettes.JPG

Picture resource from GE healthcare handbook

比較 hollow fiber vs cassette membrane 的pressure drop
對於濃縮高濃度單株抗體之影響

目的: 比較此兩種濾膜系統何者濃縮後可得到較高濃度的單株抗體(monoclonal antibody; mAb)。

實驗材料:
mAb: 142 kDa; isoelectric point: 8.16 in 5 mM acetate buffer at pH 5 with 20 mM NaCl

Experimental condition of hollow fiber and cassette.jpg
 

結果:

Compare pressure drop with hollow fiber and cassette with different concentration of mAb.JPG

 

Figure.1 中空纖維膜比起匣式濾膜有較低的pressure drop

當抗體濃度低於100 g/L,匣式濾膜的filtrate flux較中空纖維膜高,但隨著濃縮抗體的濃度增加,兩者的filtrate flux就會趨近於相等(約在200 g/L mAb時)。然由圖中結果顯示,當抗體濃度達到約>150 g/L,匣式濾膜的pressure drop驟升;而中空纖維膜與匣式濾膜於相同抗體濃度的狀況下,pressure drop皆維持的比匣式濾膜來的低很多,且當pressure drup達到500 kPa時,中空纖維膜可得到較高濃度的抗體(~300 g/L)。
因此當需求濃度愈高,pressure drop就盡可能維持越低狀態,就越有辦法提升樣品濃度。

Compare pressure drop and filtrate flux with different length of hollow fiber at different concentration of mAb.jpg

Figure.2 中空纖維膜長度 vs pressure drop

從Figure.2兩圖可看出,filtrate flux隨著中空纖維膜長度增加(20 cm, 40 cm, 65 cm),而降低,pressure drop則隨長度增加而增加,這是因為進樣抗體液與膜表面間產生與進樣方向相反的阻力,此阻力會因濾膜長度增加(增加摩擦距離與時間)而增加,進而造成抗體從retentatet端出來時流速下降(壓力下降;pressure drop上升),切向流速下降也造成filtrate flux的下降,因此長度愈長,濃縮所需時間較久且愈不利高濃度抗體的產生

總結:

Summary of the efficiency of hollow fiber and cassette at low and high concentration of mAb.jpg

 

結論:

 

Configuration of hollow fiber cartridges and flat sheet cassettes.JPG

Picture resource from GE healthcare handbook

 

由以上結果可看出若想透過濃縮得到相當高濃度的單株抗體,匣式濾膜因為結構的關係,提升抗體濃度有其先天的限制。而中空纖維膜則因樣品流向單純,有利於高濃度樣品的需求。至於長度的部分,選擇較短的中空纖維膜則有利於得到較高濃度的單株抗體

 

 

參考資料: Ultrafiltration of highly concentrated antibody solutions: Experiments and modeling for the effects of module and buffer conditions. ( Biotechnol Prog. 2016 May;32(3):692-701.) 
 

若對此實驗相關產品有興趣,可以在部落格留言與我們討論,或參考logo.jpg

Repligen Hollow fiber

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歷史上第一個接受CAR-T治療的病人是於2012年一位6歲小女孩艾蜜莉(Emily Whitehead5年後她的癌症症狀完全消失,艾蜜莉也成為CAR-T療法無窮希望的象徵。於2018 828日,吉利德科學公司(Gilead Science)宣佈以120億美元收購凱特製藥(Kite Pharma)。凱特的股票應聲從$138元上漲到$178。不過一年前,凱特的股價還不到$60元,一年之間漲了3倍。它的震撼性不是因為天價的併購金額,而是這次併購正式開啟了CAR-T癌症免疫療法(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy,簡稱CAR-T)的新紀元。

 

癌症免疫療法-CAR-T Therapy

我們的身體是由無數的細胞所組成,這些細胞和我們一樣會進行生長和複製,從而修復我們身體損壞的區域,或者使我們生長。正常細胞會有秩序地分裂和繁殖,這樣週而復始的循環就稱為細胞週期 (Cell cycle),而細胞週期是受到某些基因調控的。

然而當基因損壞時,細胞週期將失控,壞掉的細胞將無限制的不斷繁殖,侵犯周圍組織,甚至取得轉移到身體其他部位的能力,這樣就是我們俗稱的惡性腫瘤/癌症。雖免疫系統是保護人體的第一道防線,但不正常的癌細胞不斷複製的過程中,會透過某些機制,去隱藏癌細胞的特徵,以躲避免疫系統,因此,癌細胞才能如此囂張的在人體內持續繁殖,甚至轉移到其他器官。

T細胞是一種免疫細胞,負責保護身體免於外來病原的攻擊;而身體裡面的T細胞有又分很多種,其中一種名為細胞毒性T細胞(cytotoxic T cell),它的功能主要是辨識異常的細胞,分泌細胞毒素,並消滅這些細胞。

因此CAR-T療法,簡單來說就是,我們在原本無法辨識癌症的T細胞上,裝上一個名為CAR的雷達。如此一來,經過改造的T細胞就會像導彈一樣,精準的定位癌細胞位置,並將這些癌細胞殺死。

在一般癌症治療的方法相當多,傳統化療的專一性較低,容易傷到其他健康的細胞,造成全身性的副作用,如手術治療、化學治療、放射治療、標靶治療等。。而CAR-T (全名為Chimeric antigen receptor T-cell therapy) 治療是可以精準辨識出癌細胞,並將他殺死。這樣的技術,開啟了細胞療法新的扉頁。將來,面對不同的癌症,只要找出適合的雷達-CAR,我們就能請T細胞代勞,替我們對抗癌症。

 

CAR-T療法怎麼進行?

CAR-T療法是為自己的免疫細胞-T細胞裝上雷達CAR後,讓他行免疫反應對抗癌症。那實際在臨床上是怎麼執行的呢?首先,醫生會從病患的體內抽取出血液,並將抽取出的血液進行分離,挑選出T細胞。經過改造的T 細胞進行改造,會在細胞表面表現出CAR的結構,當他們成長、擴張到一定的程度後,再輸回病人體內,去對抗癌症。用自己的免疫細胞對抗癌症的優點,就是身體不會有排斥反應,是一項十分個人化的療程。

CAR-T-1.jpg

 


Hollow Fiber生產大量的載體

Lentiviral Supernatant 生產需於潔淨室的 BSC內進行。大略步驟如下:

  1. lentiviral supernatant置備

          使用 T176 Falsk 培養HEK293T,進行二次繼代。細胞數由 80x10^6 擴增至少至 2,829x10^6。之後將細胞轉殖至 CellStack,再進行病毒感染。

  2. 初步澄清

           將上清液經 0.45u PVDF 過濾

  3. 換液與濃縮

          使用KR2i Tangential Flow System (SpectrumLabs) ,以 500 kDa mPES Hollow Fiber膜進行換液與濃縮。原始體積為 4L,先進行第一步濃縮,再以 2L PBS 進行  換液。最後再濃縮成 100ml

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製造批次的品管及出產測試,以及大量生產載體的考量

大量之載體生產,都需用下列或類似方法檢驗下列性質。任何之檢驗都需包括對照組(即為已知量的檢驗)以確保檢驗結果無誤。

1. 純度測試

  1.  所得載體之DNARNA總量,可用A260A280
  2. 檢驗DNA之大小,均質性(homogeneity)、構造、是超螺旋(supercoiled)或線性(linear)結構,可用電泳膠片法。
  3. 是否被RNA或寄主DNA污染,可用電泳法或E. coli的探針(probe)來檢驗。
  4. 是否有蛋白質污染,可用電泳膠片銀染色法(silver stain)。
  5. 是否有無感染性(non-infectious)病毒,如空蛋白殼(empty capsids)的污染。
  6. 產物中是否含有毒物質。

 

2. 驗證測試

  1.  使用數種限制酶來確認載體之限制酶圖譜。
  2. 若在同一設備內製造數種不同的載體,需有可用以分辨不同結構之載體的方法

 

3. 安全性測試

  1.  嗜氧性(aerobic)及厭氧性(anaerobic)的細菌或真菌的污染檢驗。
  2. 若使用的是脊椎動物或昆蟲類的細胞株, 需檢驗是否有黴漿菌(mycoplasma)污染
  3. 檢驗是否有外來的及有複製能力之病毒的污染。製造載體之來源,常有遭受病毒污染之風險,有時在建構有複製缺陷(replication-defective)之病毒載體時,也可能遭受同類之可複製(replication-competent)病毒之污染,這些可能都需加以檢驗並排除。

 

4. 活性測試(potency

  1. 在製造過程中要有適當之活性測試方法,若無定量之方法,至少要有定性測試。活性測試主要為測量基因產物的生物活性,而不只是證明其存在。
  2. 要測量插入基因的表現能力,可將其轉移感染(transfection)至適宜之細胞內,以證明它可製造有活性的基因產物,並須測量產物活性之敏感度sensitivity)及專一性(specificity)。

 

Reference :

  1.  改造你的免疫細胞,讓他為你對抗癌症-CAR-T Therapy; H. Spectrum by Jessie Chen Feb. 01, 2018
  2. 從科學新知、到創業、到科普 – CAR-T正顛覆癌症醫療,台灣在哪裡? ; 數位時代  2017.09.20 by 鄭志凱
  3. Development of a Novel Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor: A Paradigm for an Affordable CAR T Cell Production at Academic Institutions; Molecular Therapy; Methods & Clinical Development. (https://www.cell.com/molecular-therapy-family/methods/fulltext/S2329-0501(18)30122-0)

 

關於KR2i Tangential Flow System 全自動濃縮分離系統及Hollow fiber 中空纖維膜,可參考公司連結

 

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敲開膜界的另一選擇 : 捲式膜應用於換液與濃縮

捲式膜運作基礎

將平板膜,加襯一層進料墊片,以捲式方式呈現一柱狀體,過濾方式同樣是採用切向流 (TFF)

擬濃縮樣品穿過流動通道,以切向流方式運行。濾液則穿過膜表面進入滲透物間隔區,並向下流向滲透物管內,大分子樣品則達到濃縮目的。

由於其結構簡單,可以膜材料的種類多,且可很容易地產生不同長度與直徑。

敲開膜界的另一選擇 : 捲式膜應用於換液與濃縮

 

優點

  • 膜孔大小選擇多- 奈米濾 (from 100 ~ 800 Da) ; 超濾 ( 1 ~ 800 kD) 以及 微濾 (800 kD~0.2u)
  • 分子量最小可達 100Da 以下
  • 各式材質選擇-有抗有機的PVDF膜材可使用, 用途更為廣泛
  • 價格低廉-結構簡單, 價格優

 

奈米膜.jpg

超濾膜.jpg

微濾膜.jpg

 

搭配高壓膜片式幫浦

由於構造的關係, 捲式膜可承受極高的壓力, 建議採用高壓幫浦使用

如桌上型, 可採用 ADP-H 膜片式幫浦

Maxi Pressure = 100 psi; Maxi Flow Rate = 5L

敲開膜界的另一選擇 : 捲式膜應用於換液與濃縮

 

但此系統的為其唯一的侷限........樣品要求最低處理體積較大....

若需處理較大樣品體積, 此款膜為另一種優質高效率的選擇

 

有需任何進一步資訊, 可於部落格留言與我們討論 或參考

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