SpectraFlo™ Dynamic Dialysis Systems 動態透析系統

大體積的溫和透析法~

SpectraFlo dialysis system2.JPG

 

生技醫療產業常用的透析方式是將不穩定或黏滯性高的物質以透析袋隔離並利用濃度差的方式達到去除鹽份、少量有機溶劑、小分子物質或雜質。相關原理請參考:最新透析的技術與應用

透析袋使用示意:

 


一般透析需耗費兩天兩夜且總共需更換8-10次不等的透析液才可達到最佳的透析效果,但面對大體積的樣品,除了需要又大又長的透析袋裝填外,更需要更大容器的透析桶來承載透析袋與透析液。

 

大體積透析比較,以200 ml為例:

 

傳統透析法

動態透析系統
 

02.JPG

01.JPG

空間 至少需20 L透析桶 只需2.2 L 透析柱,底座直徑僅30.5 cm
外液處理 抬起傾倒,費力 蠕動幫浦使用,省力
環境 開放式,需頻繁移動透析袋至新的透析桶中 封閉式,不需移動透析袋,較無汙染
擾流方式 磁石攪拌 流動式,可直接排放掉或循環式
濃度差 隨透析時間越久濃度差越低 一直保持高濃度差
多工性 通常一桶一袋-若一桶多放,則不能攪拌,否則易攪纏在一起 透析柱中可加上隔板,同時一柱兩袋,或串聯式透析
效率 1-2天,耗時 <1天,省時

 

使用Spectrum/Repligen的動態透析系統,因搭配蠕動幫浦自動補液換液,膜內外維持高濃度差,達到高效率透析!

Dynamic dialysis system.jpg

 

動態透析示意:

 

兩小時後,左圖靜置方式,外液呈現淡粉紅色,濃度差低;反之右圖動態透析,外液澄清無色,濃度差高

Static VS dynamic dialysis.JPG

 

一小時後,動態透析效率比靜置方式快上 10 %

Static VS dynamic dialysis-2.JPG

 

增加透析液流動速率(Flux rate),透析效果更好!

dynamic dialysis with different flow rate-2.JPG

 

也可使用串聯透析方式同時處理多個透析袋

Series Operation - SpectraFlo™ Process System .JPG

 

多種大小管柱選擇,單柱樣品體積最大可達 2 公升!

SpectraFlo™ Dynamic Dialysis with different size tank.jpg

 

若有更多濃縮透析問題,歡迎於部落格留言與我們討論,或參考

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CAR-T病毒10倍濃縮只要30分鐘!

取代離心式濃縮,以Hollow fiber中空纖維膜做切向流(tangential flow/cross flow)濃縮,省時有效率,高達95 % 以上樣品回收率!

mini TFF 切向流過濾系統 MAP.03 sytem

 

MAP.03 mini TFF system.png

 

實驗目的: 將原50 ml含有CAR-T之病毒培養液濃縮至5 ml

實驗方法: 以Spectrum_Repligen hollow fiber (C02-E300-05-N)並搭配迷你幫浦MAP.03做過濾濃縮

20190815_152449.jpg

整組Hollow fiber與連通管路以gamma ray無菌處理並於無菌操作台中操作使用,免去0.22 um過濾除菌!

 

 

  濃縮大車拼
  Hollow fiber 切向流 傳統離心
裝置圖

MAP.03 mini TFF system.JPG

spin column.jpg

原理

樣品流向平行濾膜,不易堵塞

Cross Flow.jpg

樣品流向垂直濾膜,易堵塞

Dead End.jpg

50 cc
10倍濃縮時間
約30 min 需分裝離心 15 cc/tube >1 hr
回收率 >95 % 易沾黏在膜上,回收率較差

 

迷你輕巧! 冰箱中4度C 自動操作、自動停機也OK!!

20190816_105845.jpg

 

 

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  之前從CAR-T製程過程,從細菌到病毒 (上篇)已介紹含有專一性辨認之基因片段的質體(plasmid)是如何透過細菌複製增量,接下來就是將質體送入T細胞中最終使其表現CAR於細胞表面上,送入方式常見的有電穿孔(electroporation)與病毒感染(virus infection),前者是在細胞外外加短暫高電壓,使細胞膜通透力暫時性增加來讓外源基因進入細胞中,而本篇將著重於病毒感染法來介紹。

 

電穿孔原理:

electroporation.jpg

圖片來源: Mol Ther. 2009 May;17(5):922-8.

 

簡易的病毒感染流程如下:

 

CAR-T process 2.jpg

 

何謂病毒感染式的基因轉殖呢? 簡單來說就是利用病毒會將自身DNA送到宿主細胞內的特性,將我們的目標基因送到細胞中,再利用細胞本身轉錄轉譯能力將目標基因轉譯成功能性蛋白。

在生物技術上最常使用反轉錄病毒(retrovirus)、腺病毒(adenovirus)和慢病毒(lentivirus)三種來當作我們的基因遞送者:

 

A: 反轉錄病毒(Retrovirus)

一種RNA病毒,進入宿主後會反轉錄作用將RNA反轉成DNA,並將DNA嵌入宿主染色體中,因此就能藉由宿主複製而複製,具外套膜且只能感染分裂中的細胞

 

B: 腺病毒(Adenovirus)

為一種DNA病毒,經用內吞作用(endocytosis)進入宿主細胞中,進入後再釋出其DNA進入宿主細胞核中,不具外套膜但能感染分裂中或不分裂的細胞,腺病毒最後會破宿主細胞膜而出。

 

C: 慢病毒(Lentivirus)

為一種RNA病毒,屬反轉錄病毒的一種,外套膜表面與宿主細胞膜受體辨認後藉由膜融合(membrane fusion)進入宿主中,但與反轉錄病毒的差別在於其可感染分裂或不分裂的細胞

 

以慢病毒為例,為降低基因轉殖操作的危險性,除了目標質體外,通常還有包裹載體(package vector,又稱結構蛋白載體 structure protein vector)及外套膜載體(envelope vector),將三者一同送入包裹細胞(packaging cell ex:293T)內進行複製、表現與病毒組裝,其經過逆轉錄作用製造載體DNA及轉譯出病毒的蛋白外殼與外套膜,最後於細胞中組裝成病毒型態後再釋放到細胞外。此過程通常需要兩到三天以蒐集足夠量且含有目標質體的病毒。

 

慢病毒包裝與感染步驟:

lentivirus-production-mirus-bio-recombinant.png

 

將含病毒的培養基收下來後,傳統會使用高速離心的方式分離培養基中的細胞碎屑再以超高速離心來濃縮病毒提高效價,近代則推薦使用Hollow fiber(HF) 0.5, 0.65 μm以切向流過濾的方式做培養液澄清再以300, 500 kD HF做初步濃縮,之後利用層析管柱分離出病毒,再用100, 300 kD HF做最後濃縮以及0.2 µm的無菌過濾,結合上篇所述,不論是在細菌階段或是在細胞的病毒組裝階段都可以用到切向流過濾濃縮系統(Tangential Flow system; TFF)系統來做濃縮、分離、除菌與澄清,只需更換HF與矽膠管件即可。

(參考快速病毒濃縮(無菌操作)的新思維; 不可思議!! 200倍病毒濃縮透析換液僅花35分鐘完成!!)

 

TFF 切向流過濾系統,從2 mL~500 L

Tangential Flow TFF system-2.jpg

 

得到濃縮後具有CAR的病毒後,接下來就可以用來感染從病患血液中分離出來的T細胞囉! 步驟如下圖:

 

CAR-T.jpg

 

結合上下兩篇所述, 要改造T細胞的前置步驟就需經歷: 專一性質體設計、細菌轉殖培養放大、病毒包裝放大、分離濃縮等重重步驟,這樣的演進都是結合眾多科學家們辛苦研究的結晶,才造就人類在醫療技術上的突破,雖然現今CAR-T細胞治療仍有許多副作用與侷限性,不過隨著科學與醫療快速進步,期許未來CAR-T細胞療法能更廣泛的應用與更安全。

 

 

 

 

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在先前的文章:Hollow Fiber製備CAR-T載體與品質的檢測中,我們介紹到CAR-T的原理與應用,但在使用慢病毒感染T-cell改造成CAR-T前是需要進行重重步驟,本篇將跟各位介紹具有目標基因的病毒是如何被製造,過程又大致可分為細菌培養放大質體(Plasmid)與哺乳細胞培養放大慢病毒(ex: Lentivirus),放大慢病毒的部分將在下一篇再跟大家介紹。簡易的細菌放大步驟圖如下:

 

Process of gene cloning and E-coli collection, clarification %26; concentration  .jpg

 

首先將專一性辨認目標物(ex:癌細胞)的基因片段接在載體(Vector)上,稱為基因接合作用(Gene ligation),而接合後稱為質體(Plasmid),因載體有供細菌辨認的位置,因此當基因片段送入膜通透力好的細菌(勝任細胞;Competent cell)時,質體可隨著細菌複製並繁衍下去,如此以來質體就能夠被等比放大,此步驟稱為轉形作用(Transformation)。

Porcess of gene cloning and E-coli culture-2.jpg

搭配Ultra yield flask細胞養(氧)量倍增瓶(可參考:搖瓶的小改變,細胞與產物即可倍增; 提高 E. Coli細胞密度與增進蛋白質表現的關鍵因子)與專用透氣蓋(專屬2.5L Ultra Yield 搖瓶的Vented Cap出爐了!!)將細菌置於incubator中震盪培養放大(參考:令人折服的設計:INFORS Multitron震盪培養箱),若為量產等級,則可選用發酵槽(又稱生物反應器; Bioreactor)做更大量的培養放大。

 

 

細菌經震盪培養後,可用中空纖維膜(Hollow fiber; HF) 500/750 kD收菌,之後經過破菌處理,再用HF 2 μm做質體澄清及100/300 kD做質體濃縮,此一系列的收菌、質體澄清與質體濃縮的步驟,都可以透過切向流過濾濃縮系統(Tangential Flow system; TFF)來完成(參考: 出乎意料的快與高效率之細胞分離方法!!; 「濃縮與透析」產程放大!從這二步驟開始……)

 

Hollow fiber TFF system from small to large volume

Tangential Flow TFF system-2.jpg

 


 

得到大量高濃度的質體後,就可進入下一步來製造含有CAR的病毒了!此部分留在下篇再向各位介紹囉!

 

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RAPID CLEAR® CAP 3000

Rapid clear cap 3000.jpg

      High-speed clarification of cell culture

還在用傳統濾杯過濾培養液嗎?

Filter funnel.JPG

不先把細胞分裝離心,濾杯過濾很快就塞住了…             

 

centrifuge tube cartoon.JPGcentrifuge cartoon.JPG

 

 

 

 

 

 

 

 

 

過濾救星~! THOMSON  RAPID CLEAR® CAP 3000 學士帽造型濾杯!

Rapid clear cap4.JPG

0.2 μm filter直接接在搖瓶上,免分裝離心免倒出快速又安全!

Rapid clear cap faster CHO HEK.jpg

省時省錢!   省下用離心機的時間與開銷

capital equipment cost comparison.JPG

省下13倍以上的時間!

Rapid clear cap time in minutes graph.jpg

一個學士帽抵   4個 !!   500 cc濾杯

Rapid clear cap vs filter funnel.jpg

 

搭配 Optimum Growth Flask搖瓶 瓶頸加寬,高通氣低剪切力,產量更好!

corning flask vs thomson optium growth flask.JPG

 

參考的使用體積與所需時間         註: 不同細胞總類與濃度,所需時間會略有不同

 Cell Line Viability 99 %-70 % 69 %-50 % 49 %-40 % 39 %-0 %
Spin for 7 min @ 4000 g*
 Cell Type Volume (L) Time (min) Volume (L) Time (min) Volume (L) Time (min) Volume (L) Time (min)
 CHO Stable without Feed 3.0 18 2.5 18 2.0 20 3.5** 35**
 CHO Stable, 1 to 2 Feeds 2.0 18 2.0 18 1.5 35    
 CHO Stable, 2+ Feeds Spin for 15 min @ 3000 g; ≦3 L volume **
 HEK293 (FreeStyleTM & Expi293) 3.0 18 3.0 23 3.0 25 3.5** 35**
 CHO Transient 3.0 18 2.5 18 1.5 35    
 ExpiCHO 3.0 18 2.5 18 1.0 18    

* For low viability cultures, (< 39%), centrifuge for 7 minutes prior to clarifying with the Rapid Clear® Cap 3000.
** Cell cultures that received 2+ feeds will require spinning to minimize potential clogging

 

實作影片

 

想要增進實驗效率嗎? 趕快來電詢問!!

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Configuration of hollow fiber cartridges and flat sheet cassettes.JPG

Picture resource from GE healthcare handbook

比較 hollow fiber vs cassette membrane 的pressure drop
對於濃縮高濃度單株抗體之影響

目的: 比較此兩種濾膜系統何者濃縮後可得到較高濃度的單株抗體(monoclonal antibody; mAb)。

實驗材料:
mAb: 142 kDa; isoelectric point: 8.16 in 5 mM acetate buffer at pH 5 with 20 mM NaCl

Experimental condition of hollow fiber and cassette.jpg
 

結果:

Compare pressure drop with hollow fiber and cassette with different concentration of mAb.JPG

 

Figure.1 中空纖維膜比起匣式濾膜有較低的pressure drop

當抗體濃度低於100 g/L,匣式濾膜的filtrate flux較中空纖維膜高,但隨著濃縮抗體的濃度增加,兩者的filtrate flux就會趨近於相等(約在200 g/L mAb時)。然由圖中結果顯示,當抗體濃度達到約>150 g/L,匣式濾膜的pressure drop驟升;而中空纖維膜與匣式濾膜於相同抗體濃度的狀況下,pressure drop皆維持的比匣式濾膜來的低很多,且當pressure drup達到500 kPa時,中空纖維膜可得到較高濃度的抗體(~300 g/L)。
因此當需求濃度愈高,pressure drop就盡可能維持越低狀態,就越有辦法提升樣品濃度。

Compare pressure drop and filtrate flux with different length of hollow fiber at different concentration of mAb.jpg

Figure.2 中空纖維膜長度 vs pressure drop

從Figure.2兩圖可看出,filtrate flux隨著中空纖維膜長度增加(20 cm, 40 cm, 65 cm),而降低,pressure drop則隨長度增加而增加,這是因為進樣抗體液與膜表面間產生與進樣方向相反的阻力,此阻力會因濾膜長度增加(增加摩擦距離與時間)而增加,進而造成抗體從retentatet端出來時流速下降(壓力下降;pressure drop上升),切向流速下降也造成filtrate flux的下降,因此長度愈長,濃縮所需時間較久且愈不利高濃度抗體的產生

總結:

Summary of the efficiency of hollow fiber and cassette at low and high concentration of mAb.jpg

 

結論:

 

Configuration of hollow fiber cartridges and flat sheet cassettes.JPG

Picture resource from GE healthcare handbook

 

由以上結果可看出若想透過濃縮得到相當高濃度的單株抗體,匣式濾膜因為結構的關係,提升抗體濃度有其先天的限制。而中空纖維膜則因樣品流向單純,有利於高濃度樣品的需求。至於長度的部分,選擇較短的中空纖維膜則有利於得到較高濃度的單株抗體

 

 

參考資料: Ultrafiltration of highly concentrated antibody solutions: Experiments and modeling for the effects of module and buffer conditions. ( Biotechnol Prog. 2016 May;32(3):692-701.) 
 

若對此實驗相關產品有興趣,可以在部落格留言與我們討論,或參考logo.jpg

Repligen Hollow fiber

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cross flow.jpg

 


歷史上第一個接受CAR-T治療的病人是於2012年一位6歲小女孩艾蜜莉(Emily Whitehead5年後她的癌症症狀完全消失,艾蜜莉也成為CAR-T療法無窮希望的象徵。於2018 828日,吉利德科學公司(Gilead Science)宣佈以120億美元收購凱特製藥(Kite Pharma)。凱特的股票應聲從$138元上漲到$178。不過一年前,凱特的股價還不到$60元,一年之間漲了3倍。它的震撼性不是因為天價的併購金額,而是這次併購正式開啟了CAR-T癌症免疫療法(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy,簡稱CAR-T)的新紀元。

 

癌症免疫療法-CAR-T Therapy

我們的身體是由無數的細胞所組成,這些細胞和我們一樣會進行生長和複製,從而修復我們身體損壞的區域,或者使我們生長。正常細胞會有秩序地分裂和繁殖,這樣週而復始的循環就稱為細胞週期 (Cell cycle),而細胞週期是受到某些基因調控的。

然而當基因損壞時,細胞週期將失控,壞掉的細胞將無限制的不斷繁殖,侵犯周圍組織,甚至取得轉移到身體其他部位的能力,這樣就是我們俗稱的惡性腫瘤/癌症。雖免疫系統是保護人體的第一道防線,但不正常的癌細胞不斷複製的過程中,會透過某些機制,去隱藏癌細胞的特徵,以躲避免疫系統,因此,癌細胞才能如此囂張的在人體內持續繁殖,甚至轉移到其他器官。

T細胞是一種免疫細胞,負責保護身體免於外來病原的攻擊;而身體裡面的T細胞有又分很多種,其中一種名為細胞毒性T細胞(cytotoxic T cell),它的功能主要是辨識異常的細胞,分泌細胞毒素,並消滅這些細胞。

因此CAR-T療法,簡單來說就是,我們在原本無法辨識癌症的T細胞上,裝上一個名為CAR的雷達。如此一來,經過改造的T細胞就會像導彈一樣,精準的定位癌細胞位置,並將這些癌細胞殺死。

在一般癌症治療的方法相當多,傳統化療的專一性較低,容易傷到其他健康的細胞,造成全身性的副作用,如手術治療、化學治療、放射治療、標靶治療等。。而CAR-T (全名為Chimeric antigen receptor T-cell therapy) 治療是可以精準辨識出癌細胞,並將他殺死。這樣的技術,開啟了細胞療法新的扉頁。將來,面對不同的癌症,只要找出適合的雷達-CAR,我們就能請T細胞代勞,替我們對抗癌症。

 

CAR-T療法怎麼進行?

CAR-T療法是為自己的免疫細胞-T細胞裝上雷達CAR後,讓他行免疫反應對抗癌症。那實際在臨床上是怎麼執行的呢?首先,醫生會從病患的體內抽取出血液,並將抽取出的血液進行分離,挑選出T細胞。經過改造的T 細胞進行改造,會在細胞表面表現出CAR的結構,當他們成長、擴張到一定的程度後,再輸回病人體內,去對抗癌症。用自己的免疫細胞對抗癌症的優點,就是身體不會有排斥反應,是一項十分個人化的療程。

CAR-T-1.jpg

 


Hollow Fiber生產大量的載體

Lentiviral Supernatant 生產需於潔淨室的 BSC內進行。大略步驟如下:

  1. lentiviral supernatant置備

          使用 T176 Falsk 培養HEK293T,進行二次繼代。細胞數由 80x10^6 擴增至少至 2,829x10^6。之後將細胞轉殖至 CellStack,再進行病毒感染。

  2. 初步澄清

           將上清液經 0.45u PVDF 過濾

  3. 換液與濃縮

          使用KR2i Tangential Flow System (SpectrumLabs) ,以 500 kDa mPES Hollow Fiber膜進行換液與濃縮。原始體積為 4L,先進行第一步濃縮,再以 2L PBS 進行  換液。最後再濃縮成 100ml

virus production.jpg

 


製造批次的品管及出產測試,以及大量生產載體的考量

大量之載體生產,都需用下列或類似方法檢驗下列性質。任何之檢驗都需包括對照組(即為已知量的檢驗)以確保檢驗結果無誤。

1. 純度測試

  1.  所得載體之DNARNA總量,可用A260A280
  2. 檢驗DNA之大小,均質性(homogeneity)、構造、是超螺旋(supercoiled)或線性(linear)結構,可用電泳膠片法。
  3. 是否被RNA或寄主DNA污染,可用電泳法或E. coli的探針(probe)來檢驗。
  4. 是否有蛋白質污染,可用電泳膠片銀染色法(silver stain)。
  5. 是否有無感染性(non-infectious)病毒,如空蛋白殼(empty capsids)的污染。
  6. 產物中是否含有毒物質。

 

2. 驗證測試

  1.  使用數種限制酶來確認載體之限制酶圖譜。
  2. 若在同一設備內製造數種不同的載體,需有可用以分辨不同結構之載體的方法

 

3. 安全性測試

  1.  嗜氧性(aerobic)及厭氧性(anaerobic)的細菌或真菌的污染檢驗。
  2. 若使用的是脊椎動物或昆蟲類的細胞株, 需檢驗是否有黴漿菌(mycoplasma)污染
  3. 檢驗是否有外來的及有複製能力之病毒的污染。製造載體之來源,常有遭受病毒污染之風險,有時在建構有複製缺陷(replication-defective)之病毒載體時,也可能遭受同類之可複製(replication-competent)病毒之污染,這些可能都需加以檢驗並排除。

 

4. 活性測試(potency

  1. 在製造過程中要有適當之活性測試方法,若無定量之方法,至少要有定性測試。活性測試主要為測量基因產物的生物活性,而不只是證明其存在。
  2. 要測量插入基因的表現能力,可將其轉移感染(transfection)至適宜之細胞內,以證明它可製造有活性的基因產物,並須測量產物活性之敏感度sensitivity)及專一性(specificity)。

 

Reference :

  1.  改造你的免疫細胞,讓他為你對抗癌症-CAR-T Therapy; H. Spectrum by Jessie Chen Feb. 01, 2018
  2. 從科學新知、到創業、到科普 – CAR-T正顛覆癌症醫療,台灣在哪裡? ; 數位時代  2017.09.20 by 鄭志凱
  3. Development of a Novel Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor: A Paradigm for an Affordable CAR T Cell Production at Academic Institutions; Molecular Therapy; Methods & Clinical Development. (https://www.cell.com/molecular-therapy-family/methods/fulltext/S2329-0501(18)30122-0)

 

關於KR2i Tangential Flow System 全自動濃縮分離系統及Hollow fiber 中空纖維膜,可參考公司連結

 

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Spiral System.jpg

捲式膜運作基礎

將平板膜,加襯一層進料墊片,以捲式方式呈現一柱狀體,過濾方式同樣是採用切向流 (TFF)

擬濃縮樣品穿過流動通道,以切向流方式運行。濾液則穿過膜表面進入滲透物間隔區,並向下流向滲透物管內,大分子樣品則達到濃縮目的。

由於其結構簡單,可以膜材料的種雷多,且可很容易地產生不同長度與直徑。

Spiral Membrane.jpg

 

優點

  • 膜孔大小選擇多- 奈米濾 (from 100 ~ 800 Da) ; 超濾 ( 1 ~ 800 kD) 以及 微濾 (800 kD~0.2u)
  • 分子量最小可達 100Da 以下
  • 各式材質選擇-有抗有機的PVDF膜材可使用, 用途更為廣泛
  • 價格低廉-結構簡單, 價格優

 

奈米膜.jpg

超濾膜.jpg

微濾膜.jpg

 

搭配高壓膜片式幫浦

由於構造的關係, 捲式膜可承受極高的壓力, 建議採用高壓幫浦使用

如桌上型, 可採用 ADP-H 膜片式幫浦

Maxi Pressure = 100 psi; Maxi Flow Rate = 5L

diaphgram pump.jpg

 

但此系統的為其唯一的侷限........樣品要求最低處理體積較大....

若需處理較大樣品體積, 此款膜為另一種優質高效率的選擇

 

有需任何進一步資訊, 可於部落格留言與我們討論 或參考

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Hollow Fiber.jpg

  Hollow Fiber

  • 特殊的切向流,換液濃縮效率高。
  • 分子量可選擇性多且廣 (1kD; 3kD; 5kD; 10kD; 10kD; 30kD; 50kD; 70kD; 100kD; 300kD; 500kD以及750kD等等)
  • 回收率高,達95%以上。
  • 可重複使用
  • 換液濃縮效率上是「離心管式」所無法相比擬的。

切向流.jpg

 但需配合特殊幫浦與最低處理量的要求,阻礙了樣品體積低於10cc以下的應用。

 

 專利創新的微量型新設計

  手動組.jpg

  • 創新的微量型新設計,讓微量的樣品也可利用Hollow Fiber進行換液與濃縮。
  • 最終體積可達0.5cc以下。
  • 操作簡單,2分鐘內完成安裝設定。
  • 設定好基座後,放置於4℃冰箱內,讓其自動濃縮即可。
  • 清洗後,可重複使用。

手動濃縮步驟.jpg

 

  應用範圍

  • 換液與濃縮。
  • 病毒、蛋白質、奈米、細胞、高分子聚合物等等。

 

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Ultra Yield Flask.jpg

選對培養工具

耗氧菌的E. C oli,隨著細胞增生與密度增加,對氧氣需求也逐漸的拉高。因此於培養過程中,如何提升溶氧效率為重要因子之一。

Thomson的培養瓶(Ultra Yield Flask)的設計概念,即考量如何讓菌能長的好、長的多。長的好則需提升氧氣溶解率,因此設計培養瓶底部含六組檔板,強化液體擾流,進而大幅增加培養基與氧氣接觸表面積,以提高溶氧效率。另將瓶身做廣,做寬,用以提高培養體積。當培養體積增大,總細胞數相對增加,此時所需氧氣將會更多。因此將瓶口做大,並配合特殊的換氣膜,使培養瓶擁有更多的氣體交換率。

Incubation Conditions.jpg

 

選對接種時間

利用製做一份生長曲線,了解微生物最適生長時期(對數期)的時間,並於該時期進行轉殖培養

growth curve.jpg

 

選對表現條件

@ OD 600nm = 4時,此時約為微生物對數生長期的起始期,可開始進行佳誘導。並將培養溫度調降至18 ~ 25°C,震盪速度也調降至250 rpm 以下。約24小時後,即可收樣,然後您會發現結果確實與之前不一樣了。

 

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