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  之前從CAR-T製程過程,從細菌到病毒 (上篇)已介紹含有專一性辨認之基因片段的質體(plasmid)是如何透過細菌複製增量,接下來就是將質體送入T細胞中最終使其表現CAR於細胞表面上,送入方式常見的有電穿孔(electroporation)與病毒感染(virus infection),前者是在細胞外外加短暫高電壓,使細胞膜通透力暫時性增加來讓外源基因進入細胞中,而本篇將著重於病毒感染法來介紹。

 

電穿孔原理:

electroporation.jpg

圖片來源: Mol Ther. 2009 May;17(5):922-8.

 

簡易的病毒感染流程如下:

 

CAR-T process 2.jpg

 

何謂病毒感染式的基因轉殖呢? 簡單來說就是利用病毒會將自身DNA送到宿主細胞內的特性,將我們的目標基因送到細胞中,再利用細胞本身轉錄轉譯能力將目標基因轉譯成功能性蛋白。

在生物技術上最常使用反轉錄病毒(retrovirus)、腺病毒(adenovirus)和慢病毒(lentivirus)三種來當作我們的基因遞送者:

 

A: 反轉錄病毒(Retrovirus)

一種RNA病毒,進入宿主後會反轉錄作用將RNA反轉成DNA,並將DNA嵌入宿主染色體中,因此就能藉由宿主複製而複製,具外套膜且只能感染分裂中的細胞

 

B: 腺病毒(Adenovirus)

為一種DNA病毒,經用內吞作用(endocytosis)進入宿主細胞中,進入後再釋出其DNA進入宿主細胞核中,不具外套膜但能感染分裂中或不分裂的細胞,腺病毒最後會破宿主細胞膜而出。

 

C: 慢病毒(Lentivirus)

為一種RNA病毒,屬反轉錄病毒的一種,外套膜表面與宿主細胞膜受體辨認後藉由膜融合(membrane fusion)進入宿主中,但與反轉錄病毒的差別在於其可感染分裂或不分裂的細胞

 

以慢病毒為例,為降低基因轉殖操作的危險性,除了目標質體外,通常還有包裹載體(package vector,又稱結構蛋白載體 structure protein vector)及外套膜載體(envelope vector),將三者一同送入包裹細胞(packaging cell ex:293T)內進行複製、表現與病毒組裝,其經過逆轉錄作用製造載體DNA及轉譯出病毒的蛋白外殼與外套膜,最後於細胞中組裝成病毒型態後再釋放到細胞外。此過程通常需要兩到三天以蒐集足夠量且含有目標質體的病毒。

 

慢病毒包裝與感染步驟:

lentivirus-production-mirus-bio-recombinant.png

 

將含病毒的培養基收下來後,傳統會使用高速離心的方式分離培養基中的細胞碎屑再以超高速離心來濃縮病毒提高效價,近代則推薦使用Hollow fiber(HF) 0.5, 0.65 μm以切向流過濾的方式做培養液澄清再以300, 500 kD HF做初步濃縮,之後利用層析管柱分離出病毒,再用100, 300 kD HF做最後濃縮以及0.2 µm的無菌過濾,結合上篇所述,不論是在細菌階段或是在細胞的病毒組裝階段都可以用到切向流過濾濃縮系統(Tangential Flow system; TFF)系統來做濃縮、分離、除菌與澄清,只需更換HF與矽膠管件即可。

(參考快速病毒濃縮(無菌操作)的新思維; 不可思議!! 200倍病毒濃縮透析換液僅花35分鐘完成!!)

 

TFF 切向流過濾系統,從2 mL~500 L

Tangential Flow TFF system-2.jpg

 

得到濃縮後具有CAR的病毒後,接下來就可以用來感染從病患血液中分離出來的T細胞囉! 步驟如下圖:

 

CAR-T.jpg

 

結合上下兩篇所述, 要改造T細胞的前置步驟就需經歷: 專一性質體設計、細菌轉殖培養放大、病毒包裝放大、分離濃縮等重重步驟,這樣的演進都是結合眾多科學家們辛苦研究的結晶,才造就人類在醫療技術上的突破,雖然現今CAR-T細胞治療仍有許多副作用與侷限性,不過隨著科學與醫療快速進步,期許未來CAR-T細胞療法能更廣泛的應用與更安全。

 

 

 

 

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在先前的文章:Hollow Fiber製備CAR-T載體與品質的檢測中,我們介紹到CAR-T的原理與應用,但在使用慢病毒感染T-cell改造成CAR-T前是需要進行重重步驟,本篇將跟各位介紹具有目標基因的病毒是如何被製造,過程又大致可分為細菌培養放大質體(Plasmid)與哺乳細胞培養放大慢病毒(ex: Lentivirus),放大慢病毒的部分將在下一篇再跟大家介紹。簡易的細菌放大步驟圖如下:

 

Process of gene cloning and E-coli collection, clarification %26; concentration  .jpg

 

首先將專一性辨認目標物(ex:癌細胞)的基因片段接在載體(Vector)上,稱為基因接合作用(Gene ligation),而接合後稱為質體(Plasmid),因載體有供細菌辨認的位置,因此當基因片段送入膜通透力好的細菌(勝任細胞;Competent cell)時,質體可隨著細菌複製並繁衍下去,如此以來質體就能夠被等比放大,此步驟稱為轉形作用(Transformation)。

Porcess of gene cloning and E-coli culture-2.jpg

搭配Ultra yield flask細胞養(氧)量倍增瓶(可參考:搖瓶的小改變,細胞與產物即可倍增; 提高 E. Coli細胞密度與增進蛋白質表現的關鍵因子)與專用透氣蓋(專屬2.5L Ultra Yield 搖瓶的Vented Cap出爐了!!)將細菌置於incubator中震盪培養放大(參考:令人折服的設計:INFORS Multitron震盪培養箱),若為量產等級,則可選用發酵槽(又稱生物反應器; Bioreactor)做更大量的培養放大。

 

 

細菌經震盪培養後,可用中空纖維膜(Hollow fiber; HF) 500/750 kD收菌,之後經過破菌處理,再用HF 2 μm做質體澄清及100/300 kD做質體濃縮,此一系列的收菌、質體澄清與質體濃縮的步驟,都可以透過切向流過濾濃縮系統(Tangential Flow system; TFF)來完成(參考: 出乎意料的快與高效率之細胞分離方法!!; 「濃縮與透析」產程放大!從這二步驟開始……)

 

Hollow fiber TFF system from small to large volume

Tangential Flow TFF system-2.jpg

 


 

得到大量高濃度的質體後,就可進入下一步來製造含有CAR的病毒了!此部分留在下篇再向各位介紹囉!

 

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Configuration of hollow fiber cartridges and flat sheet cassettes.JPG

Picture resource from GE healthcare handbook

比較 hollow fiber vs cassette membrane 的pressure drop
對於濃縮高濃度單株抗體之影響

目的: 比較此兩種濾膜系統何者濃縮後可得到較高濃度的單株抗體(monoclonal antibody; mAb)。

實驗材料:
mAb: 142 kDa; isoelectric point: 8.16 in 5 mM acetate buffer at pH 5 with 20 mM NaCl

Experimental condition of hollow fiber and cassette.jpg
 

結果:

Compare pressure drop with hollow fiber and cassette with different concentration of mAb.JPG

 

Figure.1 中空纖維膜比起匣式濾膜有較低的pressure drop

當抗體濃度低於100 g/L,匣式濾膜的filtrate flux較中空纖維膜高,但隨著濃縮抗體的濃度增加,兩者的filtrate flux就會趨近於相等(約在200 g/L mAb時)。然由圖中結果顯示,當抗體濃度達到約>150 g/L,匣式濾膜的pressure drop驟升;而中空纖維膜與匣式濾膜於相同抗體濃度的狀況下,pressure drop皆維持的比匣式濾膜來的低很多,且當pressure drup達到500 kPa時,中空纖維膜可得到較高濃度的抗體(~300 g/L)。
因此當需求濃度愈高,pressure drop就盡可能維持越低狀態,就越有辦法提升樣品濃度。

Compare pressure drop and filtrate flux with different length of hollow fiber at different concentration of mAb.jpg

Figure.2 中空纖維膜長度 vs pressure drop

從Figure.2兩圖可看出,filtrate flux隨著中空纖維膜長度增加(20 cm, 40 cm, 65 cm),而降低,pressure drop則隨長度增加而增加,這是因為進樣抗體液與膜表面間產生與進樣方向相反的阻力,此阻力會因濾膜長度增加(增加摩擦距離與時間)而增加,進而造成抗體從retentatet端出來時流速下降(壓力下降;pressure drop上升),切向流速下降也造成filtrate flux的下降,因此長度愈長,濃縮所需時間較久且愈不利高濃度抗體的產生

總結:

Summary of the efficiency of hollow fiber and cassette at low and high concentration of mAb.jpg

 

結論:

 

Configuration of hollow fiber cartridges and flat sheet cassettes.JPG

Picture resource from GE healthcare handbook

 

由以上結果可看出若想透過濃縮得到相當高濃度的單株抗體,匣式濾膜因為結構的關係,提升抗體濃度有其先天的限制。而中空纖維膜則因樣品流向單純,有利於高濃度樣品的需求。至於長度的部分,選擇較短的中空纖維膜則有利於得到較高濃度的單株抗體

 

 

參考資料: Ultrafiltration of highly concentrated antibody solutions: Experiments and modeling for the effects of module and buffer conditions. ( Biotechnol Prog. 2016 May;32(3):692-701.) 
 

若對此實驗相關產品有興趣,可以在部落格留言與我們討論,或參考logo.jpg

Repligen Hollow fiber

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cross flow.jpg

 


歷史上第一個接受CAR-T治療的病人是於2012年一位6歲小女孩艾蜜莉(Emily Whitehead5年後她的癌症症狀完全消失,艾蜜莉也成為CAR-T療法無窮希望的象徵。於2018 828日,吉利德科學公司(Gilead Science)宣佈以120億美元收購凱特製藥(Kite Pharma)。凱特的股票應聲從$138元上漲到$178。不過一年前,凱特的股價還不到$60元,一年之間漲了3倍。它的震撼性不是因為天價的併購金額,而是這次併購正式開啟了CAR-T癌症免疫療法(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy,簡稱CAR-T)的新紀元。

 

癌症免疫療法-CAR-T Therapy

我們的身體是由無數的細胞所組成,這些細胞和我們一樣會進行生長和複製,從而修復我們身體損壞的區域,或者使我們生長。正常細胞會有秩序地分裂和繁殖,這樣週而復始的循環就稱為細胞週期 (Cell cycle),而細胞週期是受到某些基因調控的。

然而當基因損壞時,細胞週期將失控,壞掉的細胞將無限制的不斷繁殖,侵犯周圍組織,甚至取得轉移到身體其他部位的能力,這樣就是我們俗稱的惡性腫瘤/癌症。雖免疫系統是保護人體的第一道防線,但不正常的癌細胞不斷複製的過程中,會透過某些機制,去隱藏癌細胞的特徵,以躲避免疫系統,因此,癌細胞才能如此囂張的在人體內持續繁殖,甚至轉移到其他器官。

T細胞是一種免疫細胞,負責保護身體免於外來病原的攻擊;而身體裡面的T細胞有又分很多種,其中一種名為細胞毒性T細胞(cytotoxic T cell),它的功能主要是辨識異常的細胞,分泌細胞毒素,並消滅這些細胞。

因此CAR-T療法,簡單來說就是,我們在原本無法辨識癌症的T細胞上,裝上一個名為CAR的雷達。如此一來,經過改造的T細胞就會像導彈一樣,精準的定位癌細胞位置,並將這些癌細胞殺死。

在一般癌症治療的方法相當多,傳統化療的專一性較低,容易傷到其他健康的細胞,造成全身性的副作用,如手術治療、化學治療、放射治療、標靶治療等。。而CAR-T (全名為Chimeric antigen receptor T-cell therapy) 治療是可以精準辨識出癌細胞,並將他殺死。這樣的技術,開啟了細胞療法新的扉頁。將來,面對不同的癌症,只要找出適合的雷達-CAR,我們就能請T細胞代勞,替我們對抗癌症。

 

CAR-T療法怎麼進行?

CAR-T療法是為自己的免疫細胞-T細胞裝上雷達CAR後,讓他行免疫反應對抗癌症。那實際在臨床上是怎麼執行的呢?首先,醫生會從病患的體內抽取出血液,並將抽取出的血液進行分離,挑選出T細胞。經過改造的T 細胞進行改造,會在細胞表面表現出CAR的結構,當他們成長、擴張到一定的程度後,再輸回病人體內,去對抗癌症。用自己的免疫細胞對抗癌症的優點,就是身體不會有排斥反應,是一項十分個人化的療程。

CAR-T-1.jpg

 


Hollow Fiber生產大量的載體

Lentiviral Supernatant 生產需於潔淨室的 BSC內進行。大略步驟如下:

  1. lentiviral supernatant置備

          使用 T176 Falsk 培養HEK293T,進行二次繼代。細胞數由 80x10^6 擴增至少至 2,829x10^6。之後將細胞轉殖至 CellStack,再進行病毒感染。

  2. 初步澄清

           將上清液經 0.45u PVDF 過濾

  3. 換液與濃縮

          使用KR2i Tangential Flow System (SpectrumLabs) ,以 500 kDa mPES Hollow Fiber膜進行換液與濃縮。原始體積為 4L,先進行第一步濃縮,再以 2L PBS 進行  換液。最後再濃縮成 100ml

virus production.jpg

 


製造批次的品管及出產測試,以及大量生產載體的考量

大量之載體生產,都需用下列或類似方法檢驗下列性質。任何之檢驗都需包括對照組(即為已知量的檢驗)以確保檢驗結果無誤。

1. 純度測試

  1.  所得載體之DNARNA總量,可用A260A280
  2. 檢驗DNA之大小,均質性(homogeneity)、構造、是超螺旋(supercoiled)或線性(linear)結構,可用電泳膠片法。
  3. 是否被RNA或寄主DNA污染,可用電泳法或E. coli的探針(probe)來檢驗。
  4. 是否有蛋白質污染,可用電泳膠片銀染色法(silver stain)。
  5. 是否有無感染性(non-infectious)病毒,如空蛋白殼(empty capsids)的污染。
  6. 產物中是否含有毒物質。

 

2. 驗證測試

  1.  使用數種限制酶來確認載體之限制酶圖譜。
  2. 若在同一設備內製造數種不同的載體,需有可用以分辨不同結構之載體的方法

 

3. 安全性測試

  1.  嗜氧性(aerobic)及厭氧性(anaerobic)的細菌或真菌的污染檢驗。
  2. 若使用的是脊椎動物或昆蟲類的細胞株, 需檢驗是否有黴漿菌(mycoplasma)污染
  3. 檢驗是否有外來的及有複製能力之病毒的污染。製造載體之來源,常有遭受病毒污染之風險,有時在建構有複製缺陷(replication-defective)之病毒載體時,也可能遭受同類之可複製(replication-competent)病毒之污染,這些可能都需加以檢驗並排除。

 

4. 活性測試(potency

  1. 在製造過程中要有適當之活性測試方法,若無定量之方法,至少要有定性測試。活性測試主要為測量基因產物的生物活性,而不只是證明其存在。
  2. 要測量插入基因的表現能力,可將其轉移感染(transfection)至適宜之細胞內,以證明它可製造有活性的基因產物,並須測量產物活性之敏感度sensitivity)及專一性(specificity)。

 

Reference :

  1.  改造你的免疫細胞,讓他為你對抗癌症-CAR-T Therapy; H. Spectrum by Jessie Chen Feb. 01, 2018
  2. 從科學新知、到創業、到科普 – CAR-T正顛覆癌症醫療,台灣在哪裡? ; 數位時代  2017.09.20 by 鄭志凱
  3. Development of a Novel Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor: A Paradigm for an Affordable CAR T Cell Production at Academic Institutions; Molecular Therapy; Methods & Clinical Development. (https://www.cell.com/molecular-therapy-family/methods/fulltext/S2329-0501(18)30122-0)

 

關於KR2i Tangential Flow System 全自動濃縮分離系統及Hollow fiber 中空纖維膜,可參考公司連結

 

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病毒濃縮方法, 有採用傳統透析膜 (Dialysis Mambrane)方式, 最常用的則採用 離心管 (Spin Column). 而最近比較熱門與快速的則是採用 中空纖維膜 (Hollow Fiber) 處理.

MAP.jpg

茲就其分離原理, 操作方式以及效率, 整理出一張表如下 :
 

傳統透析

 

dialysis.jpg

離心分離

 

spin column.jpg

中空纖維膜處理

MAP.jpg

原理與方法

濃度差,產生自然對流滲透

透析原理.jpg

利用透析膜內外之濃度差,以自然對流與滲透方式分離,於過程中外部之緩衝液需經常更換,以維持膜內外知濃度差異。

 

 

 

以離心力,樣品經分子篩,以Dead End方式分離

Dead End.jpg

起初樣品能順暢的經過分子篩分離出大小分子。但隨著大分子漸漸聚集,將分子篩塞住,小分子也就愈難能被分離出。

 

 

 

同樣是利用分子篩分離,但採Cross Flow式分離

Cross Flow.jpg

樣品(大小分子)持續於中空纖維膜內流動,過程中小分子會順式經由分子篩流出,而其餘尚未被分離的大小分子仍會持續不停得流動,直至分離完成。

處理時間

慢且耗時

通常需耗時二天二夜才能完成分離與換液。

稍快

 

但濃度越高離心時間越長

 

操作手續

程中需不斷的更換緩衝液,以維持一定的濃度差與透析效率。 無法執行連續式,每離心完一次,需添加新的緩衝液,再離心處理,反覆此過程。

可執行連續式換液與濃縮

 

回收率

無法濃縮樣品,甚至透析過程中常是被稀釋 樣品易因膜的關係沾黏,而大幅降低回收率 Recovery Rate > 98.5%

最低濃縮體積

樣品無法濃縮 無法預估與掌控 可設定最後濃縮體積,最小可達<0.5ml

無菌處理

不容易 不容易 可將相關管件先以 Auotclave 處理,全程於無菌操作台內進行換液與濃縮。全程無菌處理

放大處理

無法處理較大量體積 較大體積需分管處理。若更大體積將無法處理 處理體積可由 1 ml ~ 數千公升均可

Note : Hollow Fiber 可選擇的 MWCO 相當密集且廣泛: 1; 3; 5; 10; 30; 50; 70; 100; 500; 750 kD; 0.1; 0.2; 0.65 u 等等

 

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濃縮與過濾,二步驟……輕鬆放大製程

濃縮透析二步驟.jpg

 

古早的過濾與濃縮

紅龜粿.jpg

古早就有以膜方式進行濃縮的概念。如台灣有名的傳統小吃「紅龜粿」與常見的伴手禮「麻糬」,以前製作方式為利用麻袋(膜),以除去糯米水中的水分。至於製作量的多寡與所需時間長短的拿捏,則僅憑藉著師父個人經驗進行拿捏與判斷。

因應現代產品種類複雜與多樣化

常有客戶來電問「能處一噸的濃縮設備,需多少費用……..」。回答這個問題,事實上非常困難,因為現代產程所需處理的樣品種比傳統複雜、且多樣。產品特性因濃度、黏稠度的高低,都影響著過濾速度與所需花費的時間。較大系統式當然可應付,但需多大才足以應付產程所需呢?

另,也常有客戶會說「濃縮時間長短沒關係…..」。此問題也難以回答,因為中空纖維膜是沒有阻塞的問題,但膜面積卻與過濾效率息息相關。時間一拉長,如處理過程超過四~五小時以上,則產品很容易變質、變性。而多大的系統才能於五小時內完成呢?

可經由科學化二步驟,來評估系統之大小

步驟一: Pore Size與產品穩定度的評估

產品於進行量產前,建議可先取 50~500 ml樣品先進行小量的測試。利用 MicroKros Midikros Hollow Fiber Module,配合 MAP System進行不同Pore Size的效率評估測試。同時檢視樣品於經中空纖維膜處理一段時間後,產品有否因而產生變異。

Microkros %26; Midikros.jpg  MAP system.jpg

步驟二:量測Flux Rate與最佳之TMP

當通過步驟一的Pore Size與樣品穩定度測試後,可再利用MiniKros Sampler Hollow Fiber Module進行樣品1~3公升的先導型小量產測試。同時配合 "KR2i TFF System",讓電腦自動演算出該Pore Size的Flux Rate與最佳之TMP條件。

KR2i.jpg

進行量產系統評估

確定好膜的Pore Size,同時有獲得該Pore Size的Flux Rate與TMP相關條件與數據。此時使用者或業者僅需提供「未來產程所需的處理量」與「擬設定處理時間」,即可利用以上數據來進行合理化的線性放大評估。

優點

獲得高效益,降低成本

沒經過比較縝密的評估,而選用較大系統是可縮短處理時間,但過大的系統將使投資設備成本增加,未來更換所需耗材費用也較高。                                 

提升產品品質,減少時間衝擊

Pore Size的選擇於濃縮分離上是一重要議題。過小Pore Size可提升樣品回收率,但處理時間相對的過長,品質不易掌控。而較大的Pore Size是可縮短處理時間,但是會導致產品回收率降低。

 

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能讓細胞快樂生長的 Spinner Flask

 

規格

  • PTFE Cap with Silicon Sealed
  • Adjustable height stirring rod
  • The tod does not go beyond the cap : more space in incubator
  • The kit includes a glass flask, a rod with a glass, PTFE palette and a PTFE cap
  • Vessel is made by borosilicate glass
  •  

Spinner Flask.jpg

 

Double Arm Spinner Flask

  Order Number

Working Volume

Top Cap

Arm Caps

OD x H (mm)

SF-025

25

38  

GL-18

38 x 122

SF-050

50

38

GL-18

55 x 141

SF-125

125

70 

GL-32

70 x 135

SF-250

250

70 

GL-32

85 x 145

SF-500

500

70

GL-45

110 x 90


 

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試試新一代的福瑪斯達 D2瑞士環安等級殺菌消毒劑

Fermacidal D2.jpg

 

 一般最範用與耳熟能詳的殺菌劑是 --- 酒精, 只有 75% 酒精具有殺菌功效的原理:

酒精濃度愈高與其殺菌效果並不是成正比。原因是高濃度的酒精,會讓細菌的外殼瞬間凝固,使表面蛋白變性,但酒精也因此沒辦法繼續深入細菌內部了,完全不具穿透力。換言之,菌體內部仍具有活力,無法完整殺死細菌。

經研究,酒精濃度只有於75%下是最適當,於此濃度下,不但可引起蛋白質變性,並具有穿透性特性,深入細菌內部,讓細胞脫水,凝固蛋白質,達到殺菌的效果。

 

   但酒精殺菌的缺點不得不知:  

  •     75%酒精對於腸病毒、諾羅病毒,並無效用。因為這些病毒沒有脂質外殼,或是外殼比較厚,酒精也就無能為力了。
  •     刺鼻,刺激皮膚
  •     有時會傷害設備材質,如金屬、塑料、橡膠與壓克力等等。
  •     於密閉空間噴灑,容易閃燃,密閉操作,極具危險性。

 

good.png試試「福瑪斯達 D2」瑞士環安等級殺菌消毒劑的效用

  • 無臭,不刺鼻,不刺激皮膚。
  • 不染色,不會破壞材質
  • 可輕易溶解血跡
  • 清潔與殺菌任何表面,完全不會傷害設備材質。
  • 可中細菌所引起的異味
  • 無閃燃問題

 

殺菌功效

  • 對細菌與真菌非常有效
  • 有效對抗Hepatitis B, HIV, Mycobacterium (TB), Rotavirus and Influenza A virus ( H5N1 / H1N1 )

 

效能與時間

Efficacy 

Conc. (2% ready-to-use solution)

Time of reaction

Bactericide, fungicide (Candida) according to DGHM

100%

15 mins

Mycobacterium

100%

5 mins

Hepatitis B, HIV

100%

1 min

Rotavirus

100%

1 min

 

適用

  • 手部清潔,不刺激皮膚
  • INFORS Sticky Stuff (可水洗式黏貼板)
  • 培養箱與其他設備的清理消毒
  • 實驗桌、操作台等清理消毒
  • 解剖台與相關器械清理消毒
  • 無菌操作台清理消毒
  • 無菌室清理消毒

hand.jpg  surgical.jpg   

sticky stuff.jpg   

Incubator.jpg        laminar flow.jpg   

       laboratory.jpg     clean room.jpg

 

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濕度於二氧化碳培養箱上之重要性探討

minitron.jpg

基本要求:

二氧化碳培養箱功能乃是模擬生物體內的環境,進行細胞或組織的體外培養。因此培養箱最基本要求需能有穩定的溫度、CO2(以產生恆定的酸鹼值)與飽和濕度


控制型態:

目前大多的二氧化碳培養箱於調節控制「溫度」與「CO2濃度」多屬於『強制調控型』,其回復速度與精準度均可到位。然而濕度則多是採用蒸發水盤式,讓濕度自然上升。並無調控,也沒任何顯式濕度呈現於控制錶上,屬於『自我調控飽和型』。


濕度的『自我調控飽和型』的缺失與影響:

當開啟二氧化碳培養箱取出細胞或組織進行檢測時,此時二氧化碳培養箱內之培環境已經瞬間消失。再度關閉二氧化碳培養箱後,溫度與 CO2 濃度可藉由強制控制方式,於短時間內可將溫度與 CO2 濃度回至控制點。

但濕度則是利用增濕盤利用自然蒸發作用,進行自我調控飽和方式回至飽和濕度,顯而易見,其恢復速度非常的慢。倘若飽和濕氣再於未能恢復時,又需再次開啟培養箱取樣檢測,此時飽和濕度將再次消失。濕度又得再利用自我蒸發方式重新達飽和溼度。此番來來回回將使培養基水分漸漸散失,培養基濃度因此漸漸提升,甚至有產生過度乾燥的可能,使細胞或組織的滲透壓力大增,導致培養不佳,也使重複性培養無法如預期。

Humidity.jpg

 

改良方式

- 濕度採用 Innovative 「Direct Steam Humidification」Solution(DSH)強制控制型

目前最新的方式為採用外掛式加濕器(DSH)。加濕水則儲存於 5或10公升血清瓶內,該儲水瓶預先進行滅菌處理永遠保持於無菌狀態。培養箱內部則設有一濕度偵測器,當濕度低於設定值時,外掛式加濕器會引進外部無菌水至增濕槽,再由增濕槽進行二次加熱處理,此步驟二次菌水會瞬間蒸發成無菌水氣,引導入至培養箱內。

此方式可讓培養環境,快速恢復至最佳濕度狀態。且水源採用經二次滅菌處理步驟,可讓培養箱永遠保持於極度節淨的狀態。

DSH.jpg 

 

- 培養箱設有內部強制氣流循環系統 :

增加一組內部氣流循環裝置,可使培養箱溫度、CO2濃度與濕度迅速達至最佳培養條件。大大降低環境變因所導致對細胞或組織衝擊的因子。

 

FAN.jpg

綜合概要

溫度、CO2 濃度與濕度為進行細胞或組織體外培養的重要控制條件,彼此關係缺一不可,尤其是濕度控制部分至為重要。濕度的高低,影響了培養基濃度與細胞/組織的耐受度。如何讓培養條件能有所控制、重複,且能實際有所依循,濕度的控制是完全不可忽略的一環。INFORS所設計的 Minitron 與 Multitron Cell 於門開啟關閉後於3分鐘內立即可回復至溫度、CO2 與濕度的最佳培養條件。

 

Find the right CO2 incubator for your lab:

  1. http://www.lefoscience.com/products_show.php?show=81
  2. http://www.infors-ht.com/index.php/en/products/shakers/incubation-shakers/multitron-cell
  3. http://www.infors-ht.com/index.php/en/products/shakers/incubation-shakers/minitron

 

 

若有更多細胞培養問題,歡迎於部落格留言與我們討論,或參考

欣梗科技股份有限公司logo.jpg
Tel: 02-28321066
E-mail: info@lefoscience.com

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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講求透析高回收率時,常常被忽略掉因素與方法

Dialysis Tubing.jpg

透析膜一是種半透膜,高濃度的小分子經由半透膜,往低濃度擴散,直至二端濃度達至平衡。進而再次更換新的外部透析液,繼續進行透析。持續幾次此步驟,即可將樣品小分子全數被透析出。因此透析膜的材質透析膜孔徑的精細度影響透析效率甚巨。

CE (Cellulose Ester)

蛋白質對於膜的Binding程度為 CE < RC。而膜孔徑的專一性則為 CE > RC

CE Dialysis-01.jpg

透析膜一般最廣為人知的材質是RC (Regenerated Cellulose),傳統的分子量(MWCO)可選擇範圍是 3.56~8 12~14kD (詳細規格可參閱      "欣梗-RC膜" "SpectrumLabs-RC" )

隨著材料科技發展,SpectrumLabs研發出讓 RC 膜的分子量(MWCO)可選擇性更多樣化,由1 kD, 2 kD, 3.5 kD, 8 kD, 10 kD, 15 kD, 25 kD 50 kD,讓透析變得細緻化,而不是一般所認知的約略值 ( 詳細規格可參閱    "欣梗-RC-S" "SpectrumLabs-RC-S" )

而為滿足生物科技產業對高回收率的要求,發展出相較於RC膜更低蛋白吸附與對膜孔洞(MWCO)專一性高的CE膜。CE膜對蛋白質幾乎無Binding問題,且分子量 (MWCO) 專一度極佳。因此唯有此款 CE材質才能因應高回收率與高精緻度的要求,其對分子量的選擇範圍更為寬廣,由100-500D, 500-1000D, 3.5-5 kD, 8-10 kD, 20 kD, 50 kD, 100 kD, 300 kD 1000 kD (詳細規格可參閱   "欣梗-CE""SpectrumLabs-CE" )

因此一般泛用型可選擇 RC 膜,對於回收率有極高要求的樣品,如非常稀少珍貴或進行藥物釋放實驗,則建議選用 CE 膜。

 

Micro Float-A-Lyzer (超微量型透析管 for < 1ml)

Micro Float-A-Lyzer-01.jpg 詳細規格可參閱  "欣梗-FAL" or "SpectrumLabs-FAL"

操作與處理微量樣品之透析極其不易。SpectrumLabs因應此問題,提供二款特殊設計透析膜,其容量分別是100-200 µl 400-500 µl。加上樣品體積量少,因此高回收率則變得極為重要。此款透析膜採用CE膜,外加其特殊扁瓶設計,讓樣品與透析液接觸面積增加,強化透析效率。亦因此特殊設計,可輕易的將樣品利用所附的小取樣器,近乎完全被取出,低殘留。

Micro Float-A-Lyzer-02.jpg

此款其分子量的選擇範圍為100-500 D, 500-1000 D, 3.5-5 kD, 8-10 kD, 20 kD, 50 kD100 kD

 

Float-A-Lyzer G2 (便利型透析管for 1~10 ml)

Float-A-Lyzer G2-02.jpg 詳細規格可參閱  "欣梗-G2" or "SpectrumLabs-G2"

透析袋式透析膜,有幾項操作不便之處:

  1. 需使雙夾具,而夾具的位置/方式不適當,樣品極易因此於透析過程中滲漏。因此操作上須非常謹慎。
  2. 謹慎夾妥後之透析袋置於透析槽中,常常是載浮載沉,不易固定,影響透析效率。
  3. 無法中途採樣樣品。
  4. 透析袋為軟性材質,於透析過程中,樣品容易被稀釋。

Float-A-Lyzer G2-04.jpg

Float-A-Lyzer G2-03.jpg

SpectrumLabs 因此發展出一款便利型透析管,完全無需前處理與夾具,只要以pipette取樣將樣品置入於管中,蓋上螺紋蓋,即可放入透析槽內。該透析管上附有浮板,可垂直漂浮於透析槽中;透析管為圓型管柱,可降低樣品稀釋率;而透析過程中可隨時開啟螺紋上蓋,進行取樣檢測。

Float-A-Lyzer G2-01.jpg

此款透析管有 1 ml5 ml10 ml三種體積,分子量的選擇範圍為100-500 D, 500-1000 D, 3.5-5 kD, 8-10 kD, 20 kD, 50 kD100 kD

 

Tube-A-Lyzer (管中管式透析管for >10 ml)

Tube-A-Lyzer-01.jpg 詳細規格可參閱   "欣梗-TAL" or "SpectrumLabs-TAL"

此款透析管有著Float-A-Lyzer G2 (便利型透析管)的所有優點。能微處理較大體積的樣品,採用管中管設計。內管為樣品管,外管則讓透析液流動,讓樣品能持續接觸到新的透析液,增加透析效率,免除透析時需定時更換新透析液的麻煩。

Tube-A-Lyzer-02.jpg

此款透析管有 10ml30ml二種體積,其分子量的選擇範圍為100-500 D, 500-1000 D, 3.5-5 kD, 8-10 kD, 20 kD, 50 kD100 kD。若處理體積大於10 ml30 ml時,可採取併聯或串連式銜接,增加處理體積與處理效率。

 

其他注意事項

一般透析處理時間約16~24小時,但與膜孔徑(MWCO)的選擇,樣品體積,小分子濃度,外部透析液所使用的體積,外部透析液更換頻率與透析液攪拌等等,均可影響到透析時間與效率。

使用者最常讓忽略掉的是透析液的體積與換液頻率此部分因素。外部透析液體積與樣品體積差異愈大,其透析效率則愈高。一般建議比例為 100 1。換液頻率至少三次以上,於 2~3 小時後,進行第一次換液。之後4~5小時後進行第二次。最後為離開實驗室前進行第三次,讓其透析一個晚上。

以上訊息均可大大提高樣品透析效率與透析後的精緻度,並將低處理時間。

 

For More Detail, please contact as follows:

 欣梗科技股份有限公司

      www.lefoscience.com

      TEL: 02-28726874 

      e-mail: info@lefoscience.com

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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二氧化碳培養箱專用之振盪器

全世界最扁型的振盪器(shaker)

001.jpg

優點:

  1. 本體高度只有6.5 cm,因此置於細胞培養箱中時,與頂部距離遠,可放入大容量的錐形瓶(flask)。
  2. 採磁浮式馬達,穩定度高本體不振動,可長時間使用不產熱。
  3. 表面採奈米銀抗菌塗層。
  4. Shaker表面採可水洗清潔的強力黏貼板,相較夾式固定器,單位面積下可擺放更多錐形瓶,空間擺放極大化。
  5. 磁力外掛式控制器,不必開門即可調整轉速。

 

詳見影片:

 

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冷颼颼的天氣,大家都去哪裡跨年呢?

欣梗科技祝各位新的一年,新年快樂,平安幸福!

圖片來源:http://www.123newyear.com/wp-content/uploads/2015/03/new-year-messages-and-sms.jpg

Happy new year 新年快樂.png

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哇!! MAP系統~僅花8分鐘細胞濃縮完畢且恢復力8成以上!!

此實驗目的為利用D系列mPES Microkros Hollow fiber來進行草履蟲(Paramecium)細胞濃縮。原液為50ml濃縮至5ml (10x)僅花8分鐘而已!!使用MAP系統濃縮不旦省下許多時間,草履蟲細胞的恢復力高達8成以上。所以利用Hollow fiber中空纖維膜,以高流速,低TMP方式進行原生動物細胞濃縮, 可減少對樣品的傷害且花費的時間大幅度降低。

也就是說,當進行量產實驗5000ml時,僅需半天時間即可完成!

Paramecium 草履蟲 原生動物 濃縮.jpg

http://www.dfiles.me/paramecium-slide-400x.html

透析膜規格:

D02-E750-050-N, 750kD

mPES MidiKros Filters hollow fiber

濃縮系統使用:

MAP 系統 原生動物.png

有細菌細胞、原生動物細胞濃縮分離的需求?? 歡迎留言或聯絡我們欣梗科技股份有限公司

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使用新型Spectrumlab Perfusion系統!! 樣品不再受剪切力影響!!

KML-100 perfusion 設備系統到台灣囉!! 全台唯一耶!! 在南港所舉辦的發表會也圓滿結束!! 到底何謂Perfusion? 這台系統特色在哪裡呢,請點這裡唷!!

 

Kros Flo MagLev KML -100 perfusion.jpg

Participants.jpg

KML-100 .jpg

有興趣歡迎留言交流唷!! 

或連結 台灣代理 欣梗科技

 

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