Introduction

優化分離純化外泌體(Exosome)的新方法    相信大家都聽說過 Exosome  (外泌體)。 Exosome 在學術研究和臨床醫學界的市場需求正迅速增長,是細胞間重要的訊息傳遞者,其所攜帶的訊息在不同環境下會有所不同,包括 DNA 、 mRNAs 、 miRNAs 及 Protein 。Exosome直徑約為 30 – 150 nm 的小囊泡,屬於細胞外囊泡 (Extracellular Vesicles, EVs) 的一類。 其外層為雙層磷脂質,表面含有多種特異性的膜蛋白,而人類骨隨間質幹細胞 (Human Mesenchymal Stem Cell, h-MSC) 就可分泌出  Exosome 。 它們具有促進組織修復再生、調節免疫系統和抑制發炎反應的功能。 因此,在臨床治療,尤其是皮膚修護及醫美領域對 Exosome 的研究及商業需求均呈現出高度品質且大量的需求。

由於面臨到這樣一系列的需求問題,本研究提供了兩種技術系統來解決這些問題。

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Material and Method

MSC-EVs generation   
    第一部分是先進行 MSC-EVs 生成。 首先,必須要先進行 h-MSC 的擴增,使用適合 h-MSCs 增殖的培養基,去進行貼壁的細胞培養。

優化分離純化外泌體(Exosome)的新方法

    h-MSCs 達到適當的細胞密度後,移除含有提供細胞養分的培養基,並用無血清或低血清的培養基去進行培養,以減少培養基中外源性外泌體的干擾。 通常在無血清培養基中培養 48 - 72 小時後,培養基中的外泌體將在這段時間內被分泌到培養基的上清液中。如此,即可完成  MSC-EVs 的生成及收取。

 

KrosFlo TFDF System - Operated in clarification mode  

優化分離純化外泌體(Exosome)的新方法

    第二部份是利用 Repligen KrosFlo TFDF System  來進行澄清。 與傳統的澄清方式不同, TFDF 是利用了 Tangential Flow (切向流) 以及 Depth Filtration (深層過濾) 的新興技術。

優化分離純化外泌體(Exosome)的新方法

    以 Tangential Flow 的部分來說,經過 Tangential Flow 的過濾後的小分子的細胞密度會高,但通道到後面就會被大分子堵住,小分子也就會無法穿透過去,樣本就會被滯留在管內無法流出。 而 Depth Filtration ,過濾通道雖然很通暢,但能得到的細胞密度就會相對很低,因為大分子都會卡在過濾器上,無法通過。 TFDF 就是結合了上述兩者的優點,解決了各自的缺點,並有效地達到了高通率以及高密度的產物。

 

KrosFlo KR2i TFF system - Concentration and Formulation Buffer Exchange  

優化分離純化外泌體(Exosome)的新方法

    隨後再配合使用Repligen KrosFlo KR2i TFF system 進行濃縮和緩衝液的置換。 利用Hollow Fiber (中空纖維膜) Tangential Flow 過濾膜,與傳統的直線流過濾(亦稱為Dead End Filtration)不同,切向流過濾中的流體是平行於過濾膜的表面流動的。

優化分離純化外泌體(Exosome)的新方法

 

    這種流動方式減少了膜表面分子的積聚,延長了過濾過程的持續時間。 液體在膜表面平行流動時,大分子和小顆粒被滯留在膜的內側,而小分子和溶劑則會通過膜成為過濾液。 藉由循環回流的方式,過濾液可以被收集或重新被導回系統進行進一步的過濾,直至達到濃縮或分離效果。 因此,此方法可同時進行濃縮與滲濾。

 

 

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Results

TFDF®: Harvest and clarification step 

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    在利用 TFDF® 使 EV 澄清的階段,使用了孔徑為 2 - 5 μm 3 cm2  TFDF® system,循環率為 2.0 - 2.2 LPM ,產生了 650 LMH 的高滲透通量。 且與原液相比,經過 TFDF 澄清後的溶液,在濁度上有極為明顯的差距。

 

TFF®: Concentration and diafiltration of clarified harvest  

優化分離純化外泌體(Exosome)的新方法

優化分離純化外泌體(Exosome)的新方法

 

    為了濃縮 TFDF 後的澄清液,此研究還進行了 flux excursions retention experiments ,以確定分子量的 cutoff 值與其他條件是在可以擴增的操作條件下的狀態。

優化分離純化外泌體(Exosome)的新方法

 

    從剛開始進入到 Concentration 當狀態時,流速有明顯的下降至約25.8 LMH ,但之後進無論是進入到下一個Diafiltration 或是第二次的Concentration,流速都有穩定的保持在幾乎一樣的流速水平。

 

優化分離純化外泌體(Exosome)的新方法

 

    在原液稀釋 50 倍的狀況下,溶液中內容物的大小範圍很廣,但經過 TFDF 澄清後,溶液中內容物的大小範圍縮小了,並範圍近乎與Exosome 的大小相同 ( 30 – 150 nm ) ,且 Permeate 中的 EV 含量<1%

 

優化分離純化外泌體(Exosome)的新方法

TFF 的階段,回收率高於了 > 90%

 

Scalability and reproducibility - Identity

優化分離純化外泌體(Exosome)的新方法

    這是針對 EV 特異性膜蛋白標記物的一個結果圖,可以看到樣品 1 是從培養基收取的,樣品 2 是經過TFDF的狀態,樣品 3 則是經過TFF後的狀態。 特異性膜蛋白標記物 CD9CD63CD81 都呈現陽性,進一步確認 EV 的正確性。

 

Scalability and reproducibility – Potency

優化分離純化外泌體(Exosome)的新方法

    vitro wound healing assay 中,使用了經過 TFF system 後所產生的 EV 樣本, > 80% 的樣本是呈現陽性的,表明在此過程中生成的 EV 尚保持了有效性。

 

Scalability of TFDF® and TFF Downstream Steps for EV

Benchtop development scale to commercialization scale

優化分離純化外泌體(Exosome)的新方法

 

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Conclusion

    在使用 TFDF system 後的 EV,最終得到的回收率來到了 86%,並通過減去了在 TFF 之前的二次深層過濾,而大幅的簡化了實驗步驟。在操作 TFF 後則是實現了高達 92% 的高效 EV 回收率。且 TFDF TFF 的高通量,也有效地使得的下游步驟處理時間,減少了至少 3 小時的製程時長。

    本研究清楚地表明,整合TFDFTFF兩種系統的技術,相較於傳統方法,不僅簡化了很多繁瑣的步驟,及縮短了時間,降低了大量製程過程中可能會汙染的風險,並實現了最終產品的高回收率、產物的高度完整性及有效性。

 

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Reference

優化分離純化外泌體(Exosome)的新方法

 

欣梗科技 / www.lefoscience.com / 03-212-6700 / info@lefoscience.com

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