Introduction
相信大家都聽說過 Exosome (外泌體)。 Exosome 在學術研究和臨床醫學界的市場需求正迅速增長，是細胞間重要的訊息傳遞者，其所攜帶的訊息在不同環境下會有所不同，包括 DNA 、 mRNAs 、 miRNAs 及 Protein 。Exosome是直徑約為 30 – 150 nm 的小囊泡，屬於細胞外囊泡 （Extracellular Vesicles, EVs） 的一類。 其外層為雙層磷脂質，且表面含有多種特異性的膜蛋白，而人類骨隨間質幹細胞 （Human Mesenchymal Stem Cell, h-MSC） 就可分泌出 Exosome 。 它們具有促進組織修復再生、調節免疫系統和抑制發炎反應的功能。 因此，在臨床治療，尤其是皮膚修護及醫美領域對 Exosome 的研究及商業需求均呈現出高度品質且大量的需求。
由於面臨到這樣一系列的需求問題，本研究提供了兩種技術系統來解決這些問題。
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Material and Method
MSC-EVs generation
第一部分是先進行 MSC-EVs 生成。 首先，必須要先進行 h-MSC 的擴增，使用適合 h-MSCs 增殖的培養基，去進行貼壁的細胞培養。
在 h-MSCs 達到適當的細胞密度後，移除含有提供細胞養分的培養基，並用無血清或低血清的培養基去進行培養，以減少培養基中外源性外泌體的干擾。 通常在無血清培養基中培養 48 - 72 小時後，培養基中的外泌體將在這段時間內被分泌到培養基的上清液中。如此，即可完成 MSC-EVs 的生成及收取。
KrosFlo TFDF System - Operated in clarification mode
第二部份是利用 Repligen 的 KrosFlo TFDF System 來進行澄清。 與傳統的澄清方式不同， TFDF 是利用了 Tangential Flow (切向流) 以及 Depth Filtration (深層過濾) 的新興技術。
以 Tangential Flow 的部分來說，經過 Tangential Flow 的過濾後的小分子的細胞密度會高，但通道到後面就會被大分子堵住，小分子也就會無法穿透過去，樣本就會被滯留在管內無法流出。 而 Depth Filtration ，過濾通道雖然很通暢，但能得到的細胞密度就會相對很低，因為大分子都會卡在過濾器上，無法通過。 TFDF 就是結合了上述兩者的優點，解決了各自的缺點，並有效地達到了高通率以及高密度的產物。
KrosFlo KR2i TFF system - Concentration and Formulation Buffer Exchange
隨後再配合使用Repligen KrosFlo KR2i TFF system 進行濃縮和緩衝液的置換。 利用Hollow Fiber (中空纖維膜) 的 Tangential Flow 過濾膜，與傳統的直線流過濾（亦稱為Dead End Filtration）不同，切向流過濾中的流體是平行於過濾膜的表面流動的。
這種流動方式減少了膜表面分子的積聚，延長了過濾過程的持續時間。 液體在膜表面平行流動時，大分子和小顆粒被滯留在膜的內側，而小分子和溶劑則會通過膜成為過濾液。 藉由循環回流的方式，過濾液可以被收集或重新被導回系統進行進一步的過濾，直至達到濃縮或分離效果。 因此，此方法可同時進行濃縮與滲濾。
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Results
TFDF®: Harvest and clarification step
在利用 TFDF® 使 EV 澄清的階段，使用了孔徑為 2 - 5 μm 的 3 cm2 TFDF® system，循環率為 2.0 - 2.2 LPM ，產生了 650 LMH 的高滲透通量。 且與原液相比，經過 TFDF 澄清後的溶液，在濁度上有極為明顯的差距。
TFF®: Concentration and diafiltration of clarified harvest
為了濃縮 TFDF 後的澄清液，此研究還進行了 flux excursions 及 retention experiments ，以確定分子量的 cutoff 值與其他條件是在可以擴增的操作條件下的狀態。
從剛開始進入到 Concentration 當狀態時，流速有明顯的下降至約25.8 LMH ，但之後進無論是進入到下一個Diafiltration 或是第二次的Concentration，流速都有穩定的保持在幾乎一樣的流速水平。
在原液稀釋 50 倍的狀況下，溶液中內容物的大小範圍很廣，但經過 TFDF 澄清後，溶液中內容物的大小範圍縮小了，並範圍近乎與Exosome 的大小相同 ( 30 – 150 nm ) ，且 Permeate 中的 EV 含量<1% 。
在 TFF 的階段，回收率高於了 > 90%。
Scalability and reproducibility - Identity
這是針對 EV 特異性膜蛋白標記物的一個結果圖，可以看到樣品 1 是從培養基收取的，樣品 2 是經過TFDF的狀態，樣品 3 則是經過TFF後的狀態。 特異性膜蛋白標記物 CD9、CD63、CD81 都呈現陽性，進一步確認 EV 的正確性。
Scalability and reproducibility – Potency
在 vitro wound healing assay 中，使用了經過 TFF system 後所產生的 EV 樣本， > 80% 的樣本是呈現陽性的，表明在此過程中生成的 EV 尚保持了有效性。
Scalability of TFDF® and TFF Downstream Steps for EV
Benchtop development scale to commercialization scale
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Conclusion
在使用 TFDF system 後的 EV，最終得到的回收率來到了 86%，並通過減去了在 TFF 之前的二次深層過濾，而大幅的簡化了實驗步驟。在操作 TFF 後則是實現了高達 92% 的高效 EV 回收率。且 TFDF 和 TFF 的高通量，也有效地使得的下游步驟處理時間，減少了至少 3 小時的製程時長。
本研究清楚地表明，整合TFDF和TFF兩種系統的技術，相較於傳統方法，不僅簡化了很多繁瑣的步驟，及縮短了時間，降低了大量製程過程中可能會汙染的風險，並實現了最終產品的高回收率、產物的高度完整性及有效性。
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Reference
欣梗科技 / www.lefoscience.com / 03-212-6700 / info@lefoscience.com
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