實驗室中常利用培養瓶培養細胞和微生物,而研究人員們該如何提高培養瓶的產量呢?

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增加產量之前,要先了解影響產量的原因

 ** 產量不佳的原因:氧氣含量不足、養分不足、培養被中斷及反覆操作實驗 **

量產的關鍵方法:

  1. 選擇培養瓶合適的振幅及轉速 (另可參閱"最人性化的震盪培養箱")
  2. 降低體積以增加氧氣轉換率
  3. 使用特殊的培養瓶 (另可參閱 "提高 E. Coli細胞密度與增進蛋白質表現的關鍵因子")
  4. 足夠的養份
  5. 減少干擾:智慧處理及線上即時監控
  6. 接種(clone)時要小心

 

首先, 選擇培養瓶合適的振幅及轉速,

振幅及轉速對氧氣轉換有很大影響,根據不同狀況調整振幅則能夠提供更好的氧氣轉換率及細胞生長的條件。

一般來說,

25 mL至2 L的培養瓶適用25 mm振幅

2 L至5 L的培養瓶適用50 mm的振幅

微量多孔盤適用3 mm的振幅,轉速約800-1000/min

以微生物(細菌,酵母,真菌)飼養為例:使用25 mm振幅,轉速約120-400/min(300/min最佳)speed-conversion-chart.jpg

 

 

接著是降低培養體積以增加氧氣轉換率

培養瓶中的氧氣轉換率通常遠低於發酵槽,傳統做法為使用培養瓶中20-25%的體積空間培養,主要有利於生產生物有機物質、低耗氧生物及生長速率較慢之培養物,但可能會降低氧氣轉換率而不利於細胞生長。

若實驗方法並無限制生長條件,確保最大的液/氣界面的面積以利培養瓶中的氧氣和二氧化碳交換才能提高產量。

將培養量減少到培養瓶體積的10%,轉動時液體會均勻分布於瓶壁,增加液/氣界面的面積而提高氧氣轉換率。

 

使用特殊的培養瓶也能使產量提高,

常見的錐形瓶表面光滑,能使液體於瓶中均勻混合,但不利於氧氣交換,故並非專門作為培養之容器。

特殊設計的培養瓶如Fernbach,其瓶底擋板的作用與發酵槽中的擋板相同,能在培養瓶底端型成湍流區域擾亂液體培養物的平穩流動而改善了氣體傳輸,甚至使培養瓶利於動物細胞培養。

Thomson Optimum Growth養瓶是更專業的容器,有獨特的設計及擋板,適用於哺乳動物、昆蟲和微生物細胞,且能利用培養瓶中60%的體積空間培養,提高產量。而為了增加產量及符合此培養瓶的特性,需有特殊的培養空間及shaker配合。

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足夠的養份也是量產的重要條件,

細胞生長狀況受多種因素影響,故無法僅依靠改善氧氣轉換率去增加細胞的生長,如碳源耗盡時,無論有多少氧氣,細胞都不會達到更高的密度。因此,培養液及營養添加劑的選擇非常重要。

建議培養液中要有:基質(碳來源)、氮來源、外加微量元素和維生素、緩衝液(維持理想pH值)

基質濃度過高會抑制細胞生長,培養初期不宜將大量基質(如葡萄糖)加入培養瓶中,而是要透過定時投放基質來維持細胞生長。

在培養瓶中加入基質可透過手動及自動,而使用aquila biolabs LIS(液體注射系統)能簡化一系列補充基質的過程,不中斷培養且省時省力。

 

此外,利用智慧處理及線上即時監控減少培養時的干擾也能讓產量提升,

開啟培養箱取出培養瓶時會造成熱能流失及中斷晃動,可能會破壞細胞正常的生長曲線而影響實驗,因此應避免重複開門或長時間取出燒瓶

減輕影響的方法:快速停止並重新啟動(減少停機時間)、使環境快速回到設定狀態、自動進料、線上即時監控

研究所需的監測數據通常要透過取樣,且無法從單一培養瓶獲得,而取樣會破壞最佳的生長環境且容易有人為錯誤,如分析錯誤或數據遺漏,這些都會對實驗結果造成負面影響。

aquila biolabs CGQ (Cell Growth Quantifier) 可以在不影響樣本的狀況下準確、連續地測量培養瓶中的生物質濃度,且能同時測量多個培養瓶。

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最後則是減少培養物本身的影響,

細胞株必須搭配正確的培養基類型,且本身能夠使用培養瓶進行培養(不受剪切力影響),

為了使細胞快速生長,必須使用處於對數生長期且新鮮的細胞株

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