歷史上第一個接受CAR-T治療的病人是於2012年一位6歲小女孩艾蜜莉（Emily Whitehead），5年後她的癌症症狀完全消失，艾蜜莉也成為CAR-T療法無窮希望的象徵。於2018 年8月28日，吉利德科學公司（Gilead Science）宣佈以120億美元收購凱特製藥（Kite Pharma）。凱特的股票應聲從$138元上漲到$178。不過一年前，凱特的股價還不到$60元，一年之間漲了3倍。它的震撼性不是因為天價的併購金額，而是這次併購正式開啟了CAR-T癌症免疫療法（Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，簡稱CAR-T）的新紀元。
癌症免疫療法－CAR-T Therapy
我們的身體是由無數的細胞所組成，這些細胞和我們一樣會進行生長和複製，從而修復我們身體損壞的區域，或者使我們生長。正常細胞會有秩序地分裂和繁殖，這樣週而復始的循環就稱為細胞週期 (Cell cycle)，而細胞週期是受到某些基因調控的。
然而當基因損壞時，細胞週期將失控，壞掉的細胞將無限制的不斷繁殖，侵犯周圍組織，甚至取得轉移到身體其他部位的能力，這樣就是我們俗稱的惡性腫瘤/癌症。雖免疫系統是保護人體的第一道防線，但不正常的癌細胞不斷複製的過程中，會透過某些機制，去隱藏癌細胞的特徵，以躲避免疫系統，因此，癌細胞才能如此囂張的在人體內持續繁殖，甚至轉移到其他器官。
T細胞是一種免疫細胞，負責保護身體免於外來病原的攻擊；而身體裡面的T細胞有又分很多種，其中一種名為細胞毒性T細胞(cytotoxic T cell)，它的功能主要是辨識異常的細胞，分泌細胞毒素，並消滅這些細胞。
因此CAR-T療法，簡單來說就是，我們在原本無法辨識癌症的T細胞上，裝上一個名為CAR的雷達。如此一來，經過改造的T細胞就會像導彈一樣，精準的定位癌細胞位置，並將這些癌細胞殺死。
在一般癌症治療的方法相當多，傳統化療的專一性較低，容易傷到其他健康的細胞，造成全身性的副作用，如手術治療、化學治療、放射治療、標靶治療等。。而CAR-T (全名為Chimeric antigen receptor T-cell therapy) 治療是可以精準辨識出癌細胞，並將他殺死。這樣的技術，開啟了細胞療法新的扉頁。將來，面對不同的癌症，只要找出適合的雷達-CAR，我們就能請T細胞代勞，替我們對抗癌症。
CAR-T療法怎麼進行？
CAR-T療法是為自己的免疫細胞-T細胞裝上雷達CAR後，讓他行免疫反應對抗癌症。那實際在臨床上是怎麼執行的呢？首先，醫生會從病患的體內抽取出血液，並將抽取出的血液進行分離，挑選出T細胞。經過改造的T 細胞進行改造，會在細胞表面表現出CAR的結構，當他們成長、擴張到一定的程度後，再輸回病人體內，去對抗癌症。用自己的免疫細胞對抗癌症的優點，就是身體不會有排斥反應，是一項十分個人化的療程。
Hollow Fiber生產大量的載體
Lentiviral Supernatant 生產需於潔淨室的 BSC內進行。大略步驟如下：
- lentiviral supernatant置備
使用 T176 Falsk 培養HEK293T，進行二次繼代。細胞數由 80x10^6 擴增至少至 2,829x10^6。之後將細胞轉殖至 CellStack，再進行病毒感染。
- 初步澄清
將上清液經 0.45u PVDF 過濾
- 換液與濃縮
使用KR2i Tangential Flow System (SpectrumLabs) ，以 500 kDa mPES Hollow Fiber膜進行換液與濃縮。原始體積為 4L，先進行第一步濃縮，再以 2L PBS 進行 換液。最後再濃縮成 100ml
製造批次的品管及出產測試，以及大量生產載體的考量
大量之載體生產，都需用下列或類似方法檢驗下列性質。任何之檢驗都需包括對照組（即為已知量的檢驗）以確保檢驗結果無誤。
1. 純度測試
- 所得載體之DNA或RNA總量，可用A260／A280。
- 檢驗DNA之大小，均質性（homogeneity）、構造、是超螺旋（supercoiled）或線性（linear）結構，可用電泳膠片法。
- 是否被RNA或寄主DNA污染，可用電泳法或E. coli的探針（probe）來檢驗。
- 是否有蛋白質污染，可用電泳膠片銀染色法（silver stain）。
- 是否有無感染性（non-infectious）病毒，如空蛋白殼（empty capsids）的污染。
- 產物中是否含有毒物質。
2. 驗證測試
- 使用數種限制酶來確認載體之限制酶圖譜。
- 若在同一設備內製造數種不同的載體，需有可用以分辨不同結構之載體的方法。
3. 安全性測試
- 嗜氧性(aerobic）及厭氧性（anaerobic）的細菌或真菌的污染檢驗。
- 若使用的是脊椎動物或昆蟲類的細胞株， 需檢驗是否有黴漿菌（mycoplasma）污染 。
- 檢驗是否有外來的及有複製能力之病毒的污染。製造載體之來源，常有遭受病毒污染之風險，有時在建構有複製缺陷（replication-defective）之病毒載體時，也可能遭受同類之可複製（replication-competent）病毒之污染，這些可能都需加以檢驗並排除。
4. 活性測試（potency）
- 在製造過程中要有適當之活性測試方法，若無定量之方法，至少要有定性測試。活性測試主要為測量基因產物的生物活性，而不只是證明其存在。
- 要測量插入基因的表現能力，可將其轉移感染（transfection）至適宜之細胞內，以證明它可製造有活性的基因產物，並須測量產物活性之敏感度（sensitivity）及專一性（specificity）。
Reference :
- 改造你的免疫細胞，讓他為你對抗癌症－CAR-T Therapy; H. Spectrum by Jessie Chen Feb. 01, 2018
- 從科學新知、到創業、到科普 – CAR-T正顛覆癌症醫療，台灣在哪裡？ ; 數位時代 2017.09.20 by 鄭志凱
- Development of a Novel Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor: A Paradigm for an Affordable CAR T Cell Production at Academic Institutions; Molecular Therapy; Methods & Clinical Development. (https://www.cell.com/molecular-therapy-family/methods/fulltext/S2329-0501(18)30122-0)
關於KR2i Tangential Flow System 全自動濃縮分離系統及Hollow fiber 中空纖維膜，可參考公司連結
欣梗科技股份有限公司
Tel: 02-28321066
E-mail: info@lefoscience.com
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