在先前的文章:Hollow Fiber製備CAR-T載體與品質的檢測中,我們介紹到CAR-T的原理與應用,但在使用慢病毒感染T-cell改造成CAR-T前是需要進行重重步驟,本篇將跟各位介紹具有目標基因的病毒是如何被製造,過程又大致可分為細菌培養放大質體(Plasmid)與哺乳細胞培養放大慢病毒(ex: Lentivirus),放大慢病毒的部分將在下一篇再跟大家介紹。簡易的細菌放大步驟圖如下:

 

Process of gene cloning and E-coli collection, clarification %26; concentration  .jpg

 

首先將專一性辨認目標物(ex:癌細胞)的基因片段接在載體(Vector)上,稱為基因接合作用(Gene ligation),而接合後稱為質體(Plasmid),因載體有供細菌辨認的位置,因此當基因片段送入膜通透力好的細菌(勝任細胞;Competent cell)時,質體可隨著細菌複製並繁衍下去,如此以來質體就能夠被等比放大,此步驟稱為轉形作用(Transformation)。

Porcess of gene cloning and E-coli culture-2.jpg

搭配Ultra yield flask細胞養(氧)量倍增瓶(可參考:搖瓶的小改變,細胞與產物即可倍增; 提高 E. Coli細胞密度與增進蛋白質表現的關鍵因子)與專用透氣蓋(專屬2.5L Ultra Yield 搖瓶的Vented Cap出爐了!!)將細菌置於incubator中震盪培養放大(參考:令人折服的設計:INFORS Multitron震盪培養箱),若為量產等級,則可選用發酵槽(又稱生物反應器; Bioreactor)做更大量的培養放大。

 

 

細菌經震盪培養後,可用中空纖維膜(Hollow fiber; HF) 500/750 kD收菌,之後經過破菌處理,再用HF 2 μm做質體澄清及100/300 kD做質體濃縮,此一系列的收菌、質體澄清與質體濃縮的步驟,都可以透過切向流過濾濃縮系統(Tangential Flow system; TFF)來完成(參考: 出乎意料的快與高效率之細胞分離方法!!; 「濃縮與透析」產程放大!從這二步驟開始……)

 

Hollow fiber TFF system from small to large volume

Tangential Flow TFF system-2.jpg

 


 

得到大量高濃度的質體後,就可進入下一步來製造含有CAR的病毒了!此部分留在下篇再向各位介紹囉!

 

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