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歷史上第一個接受CAR-T治療的病人是於2012年一位6歲小女孩艾蜜莉(Emily Whitehead5年後她的癌症症狀完全消失,艾蜜莉也成為CAR-T療法無窮希望的象徵。於2018 828日,吉利德科學公司(Gilead Science)宣佈以120億美元收購凱特製藥(Kite Pharma)。凱特的股票應聲從$138元上漲到$178。不過一年前,凱特的股價還不到$60元,一年之間漲了3倍。它的震撼性不是因為天價的併購金額,而是這次併購正式開啟了CAR-T癌症免疫療法(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy,簡稱CAR-T)的新紀元。

 

癌症免疫療法-CAR-T Therapy

我們的身體是由無數的細胞所組成,這些細胞和我們一樣會進行生長和複製,從而修復我們身體損壞的區域,或者使我們生長。正常細胞會有秩序地分裂和繁殖,這樣週而復始的循環就稱為細胞週期 (Cell cycle),而細胞週期是受到某些基因調控的。

然而當基因損壞時,細胞週期將失控,壞掉的細胞將無限制的不斷繁殖,侵犯周圍組織,甚至取得轉移到身體其他部位的能力,這樣就是我們俗稱的惡性腫瘤/癌症。雖免疫系統是保護人體的第一道防線,但不正常的癌細胞不斷複製的過程中,會透過某些機制,去隱藏癌細胞的特徵,以躲避免疫系統,因此,癌細胞才能如此囂張的在人體內持續繁殖,甚至轉移到其他器官。

T細胞是一種免疫細胞,負責保護身體免於外來病原的攻擊;而身體裡面的T細胞有又分很多種,其中一種名為細胞毒性T細胞(cytotoxic T cell),它的功能主要是辨識異常的細胞,分泌細胞毒素,並消滅這些細胞。

因此CAR-T療法,簡單來說就是,我們在原本無法辨識癌症的T細胞上,裝上一個名為CAR的雷達。如此一來,經過改造的T細胞就會像導彈一樣,精準的定位癌細胞位置,並將這些癌細胞殺死。

在一般癌症治療的方法相當多,傳統化療的專一性較低,容易傷到其他健康的細胞,造成全身性的副作用,如手術治療、化學治療、放射治療、標靶治療等。。而CAR-T (全名為Chimeric antigen receptor T-cell therapy) 治療是可以精準辨識出癌細胞,並將他殺死。這樣的技術,開啟了細胞療法新的扉頁。將來,面對不同的癌症,只要找出適合的雷達-CAR,我們就能請T細胞代勞,替我們對抗癌症。

 

CAR-T療法怎麼進行?

CAR-T療法是為自己的免疫細胞-T細胞裝上雷達CAR後,讓他行免疫反應對抗癌症。那實際在臨床上是怎麼執行的呢?首先,醫生會從病患的體內抽取出血液,並將抽取出的血液進行分離,挑選出T細胞。經過改造的T 細胞進行改造,會在細胞表面表現出CAR的結構,當他們成長、擴張到一定的程度後,再輸回病人體內,去對抗癌症。用自己的免疫細胞對抗癌症的優點,就是身體不會有排斥反應,是一項十分個人化的療程。

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Hollow Fiber生產大量的載體

Lentiviral Supernatant 生產需於潔淨室的 BSC內進行。大略步驟如下:

  1. lentiviral supernatant置備

          使用 T176 Falsk 培養HEK293T,進行二次繼代。細胞數由 80x10^6 擴增至少至 2,829x10^6。之後將細胞轉殖至 CellStack,再進行病毒感染。

  2. 初步澄清

           將上清液經 0.45u PVDF 過濾

  3. 換液與濃縮

          使用KR2i Tangential Flow System (SpectrumLabs) ,以 500 kDa mPES Hollow Fiber膜進行換液與濃縮。原始體積為 4L,先進行第一步濃縮,再以 2L PBS 進行  換液。最後再濃縮成 100ml

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製造批次的品管及出產測試,以及大量生產載體的考量

大量之載體生產,都需用下列或類似方法檢驗下列性質。任何之檢驗都需包括對照組(即為已知量的檢驗)以確保檢驗結果無誤。

1. 純度測試

  1.  所得載體之DNARNA總量,可用A260A280
  2. 檢驗DNA之大小,均質性(homogeneity)、構造、是超螺旋(supercoiled)或線性(linear)結構,可用電泳膠片法。
  3. 是否被RNA或寄主DNA污染,可用電泳法或E. coli的探針(probe)來檢驗。
  4. 是否有蛋白質污染,可用電泳膠片銀染色法(silver stain)。
  5. 是否有無感染性(non-infectious)病毒,如空蛋白殼(empty capsids)的污染。
  6. 產物中是否含有毒物質。

 

2. 驗證測試

  1.  使用數種限制酶來確認載體之限制酶圖譜。
  2. 若在同一設備內製造數種不同的載體,需有可用以分辨不同結構之載體的方法

 

3. 安全性測試

  1.  嗜氧性(aerobic)及厭氧性(anaerobic)的細菌或真菌的污染檢驗。
  2. 若使用的是脊椎動物或昆蟲類的細胞株, 需檢驗是否有黴漿菌(mycoplasma)污染
  3. 檢驗是否有外來的及有複製能力之病毒的污染。製造載體之來源,常有遭受病毒污染之風險,有時在建構有複製缺陷(replication-defective)之病毒載體時,也可能遭受同類之可複製(replication-competent)病毒之污染,這些可能都需加以檢驗並排除。

 

4. 活性測試(potency

  1. 在製造過程中要有適當之活性測試方法,若無定量之方法,至少要有定性測試。活性測試主要為測量基因產物的生物活性,而不只是證明其存在。
  2. 要測量插入基因的表現能力,可將其轉移感染(transfection)至適宜之細胞內,以證明它可製造有活性的基因產物,並須測量產物活性之敏感度sensitivity)及專一性(specificity)。

 

Reference :

  1.  改造你的免疫細胞,讓他為你對抗癌症-CAR-T Therapy; H. Spectrum by Jessie Chen Feb. 01, 2018
  2. 從科學新知、到創業、到科普 – CAR-T正顛覆癌症醫療,台灣在哪裡? ; 數位時代  2017.09.20 by 鄭志凱
  3. Development of a Novel Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor: A Paradigm for an Affordable CAR T Cell Production at Academic Institutions; Molecular Therapy; Methods & Clinical Development. (https://www.cell.com/molecular-therapy-family/methods/fulltext/S2329-0501(18)30122-0)

 

關於KR2i Tangential Flow System 全自動濃縮分離系統及Hollow fiber 中空纖維膜,可參考公司連結

 

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E-mail: info@lefoscience.com

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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